重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子新劑型研究.pdf

1、目的：重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子（Recombinant human granulocyte-macrophage stimulating factor，rhGM-CSF）是由骨髓分化而成，并可由骨髓前提細(xì)胞分離得到，它是一種非糖基化的水溶性蛋白質(zhì)，由127個(gè)氨基酸組成。rhGM-CSF的主要作用是對(duì)粒細(xì)胞系和單核細(xì)胞系細(xì)胞的維持存活、促進(jìn)生長(zhǎng)、誘導(dǎo)分化和增強(qiáng)功能等。基于臨床研究的應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)rhGM-CSF應(yīng)用于燙傷、燒傷等疾病領(lǐng)域，

2、并顯示了良好的療效。
　　 目前，臨床上主要采用注射劑含漱等治療途徑，考慮到局部外用治療，并保證安全、有效、穩(wěn)定、使用方便的前提，本課題研制了rhGM-CSF外用溶液劑型，主要用于皮膚的燙傷、燒傷等疾病。它可直接作用于患病部位，從而避免肝臟的首過(guò)效應(yīng)和胃腸道的降解反應(yīng)及有關(guān)的副作用，攜帶使用方便。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)選擇重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子發(fā)酵液作為提取材料，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上初步確定重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子的

3、制備方法。將大腸桿菌表達(dá)的rhGM-CSF經(jīng)過(guò)超聲波破碎后收集包涵體，通過(guò)包涵體的變性和復(fù)性操作得到粗提的蛋白質(zhì)，通過(guò)層析步驟得到提純的重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子原液。
　　 rhGM-CSF外用溶液處方設(shè)計(jì)與篩選試驗(yàn)分別考察了pH篩選，穩(wěn)定劑的篩選，透皮吸收促進(jìn)劑的篩選。為了考察pH值對(duì)rhGM-CSF外用溶液.的生物活性的影響，在處方中其他成分用量固定的前提下，將不同用量的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉對(duì)試驗(yàn)樣品pH值的影響。本試

4、驗(yàn)選擇不同的穩(wěn)定劑加入到制劑當(dāng)中，HT、DB、TG和GT，通過(guò)25±2℃加速試驗(yàn)，以選擇最佳的保護(hù)劑。確定保護(hù)劑后，在其他組分固定的情況下，將保護(hù)劑按照不同比例，加到樣品當(dāng)中，通過(guò)25±2℃加速30天，最終確定處方用量。本試驗(yàn)選擇TW、BZ、SD作為參考，通過(guò)25±2℃加速試驗(yàn)來(lái)考察它們對(duì)于制劑穩(wěn)定性的影響。最后確定了rhGM-CSF外用溶液的最佳處方。
　　 處方確定后進(jìn)行穩(wěn)定性考察，制備了三批GM-CSF制劑樣品，置于40±

5、2℃，254±2℃，2～10℃三種條件下放置，以考察任何rhGM-CSF外用溶液樣品的外觀、pH值、生物活性、無(wú)菌檢查等方面的變化情況。
　　 結(jié)合《中國(guó)藥典》中rhGM-CSF產(chǎn)品的要求及通則中對(duì)外用溶液產(chǎn)品的要求，制訂了GM-CSF外用溶液的質(zhì)檢規(guī)程草案。分別對(duì)樣品外觀、pH值、效價(jià)測(cè)定、蛋白含量測(cè)定、裝量、無(wú)菌等方面進(jìn)行了研究。
　　 rhGM-CSF外用溶液治療燒傷的藥效試驗(yàn)：選用家兔為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?gòu)建淺Ⅱ度燒傷實(shí)

6、驗(yàn)?zāi)Ｐ?，隨機(jī)分組，分別涂抹rhGM-CSF外用溶液（70μg/ml、35 μg/ml、15gg/ml）、rhGM-CSF原液（35 μg/ml）、外用溶液空白溶液、生理鹽水，每次涂抹3下，每次涂抹共約0.4ml，每天定時(shí)給2次，連續(xù)7天。
　　 rhGM-CSF外用溶液用于治療燙傷的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，選用家兔為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?gòu)建燙傷模型，隨機(jī)分組，每只家兔的六處創(chuàng)面分別給予的藥物為：rhGM-CSF外用溶液70 μg/ml、35μg/ml

7、、15 μg/ml、rhGM-CSF原液35μg/ml、外用溶液空白溶液、生理鹽水。每次涂抹3下，每次涂抹共約0.4ml，每天定時(shí)給2次，連續(xù)7天。
　　 rhGM-CSF外用溶液對(duì)動(dòng)物皮膚急性毒性試驗(yàn)，觀察rhGM-CSF外用溶液對(duì)家兔完整皮膚及破損皮膚短期接觸所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)。急性毒性試驗(yàn)和資料，是對(duì)藥物一次性給予大劑量的安全性考察，按照皮膚急性毒性的試驗(yàn)要求，受試藥物劑量超過(guò)有效濃度的20倍時(shí)，仍未出現(xiàn)異常反映或死亡，即可

8、提示藥物的安全性。參考藥效試驗(yàn)中的高劑量70 μg/ml，此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了1.4mg/ml。
　　 rhGM-CSF外用溶液刺激性研究，試驗(yàn)包括皮膚過(guò)敏試驗(yàn)和皮膚刺激試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為豚鼠，按體重性別隨機(jī)均分組，每組5只雌雄各半。通過(guò)動(dòng)物皮膚接觸受試物后，觀察機(jī)體免疫系統(tǒng)反應(yīng)在皮膚上的表現(xiàn)或觀察藥物對(duì)家兔皮膚多次給藥所產(chǎn)生的刺激反應(yīng)。
　　 結(jié)果：按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)從發(fā)酵液中提取rhGM-CSF原液。在篩方試驗(yàn)中將不同pH值的試驗(yàn)樣

9、品通過(guò)25±2℃加速30天，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，磷酸氫二鈉的用量為29g/L，磷酸二氫鈉的用量為2.0g/L時(shí)，樣品pH值約為7.2，此時(shí)對(duì)rhGM-CSF外用溶液的生物活性影響小。
　　 通過(guò)25±2℃加速試驗(yàn)，選擇最佳的保護(hù)劑為HZT.。在其他組分固定的情況下，將HZT.按不同比例，加到樣品當(dāng)中，通過(guò)25±2℃加速30天，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HZT.用量為300g時(shí)，活性損失最小，當(dāng)其濃度再增加時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致樣品溶液粘度增加，最終確定處方

10、用量為300g/L。通過(guò)透皮劑研究選擇SD.作為制劑中的透皮吸收促進(jìn)劑。
　　 處方確定后樣品穩(wěn)定性考察，通過(guò)三批樣品40±2℃、25±2℃條件下的初步穩(wěn)定性考察、4-8℃長(zhǎng)期穩(wěn)定性，GM-CSF外用溶液樣品的外觀、pH值、無(wú)菌檢查、生物活性等各項(xiàng)指標(biāo)均未發(fā)生明顯變化，樣品穩(wěn)定性較好。通過(guò)質(zhì)量研究起草了rhGM-CSF外用溶液的質(zhì)檢規(guī)程草案。
　　 rhGM-CSF外用溶液治療燒傷的藥效試驗(yàn)中可以看到，rhGM-CSF外

11、用溶液組給藥后，燒傷創(chuàng)面愈合明顯加快，用t檢驗(yàn)方法分析。試藥組與對(duì)照組比較有顯著差異，原液組與外用溶液空白溶液組比較也有明顯差異，表明rhGM-CSF外用溶液組與原液組對(duì)燒傷均有明顯的治療作用，外用溶液組較原液組效果好一些，說(shuō)明制劑組方的合理性。
　　 rhGM-CSF外用溶液用于治療燙傷的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)中可以看到，rhGM-CSF外用溶液組給藥后，燙傷創(chuàng)面愈合明顯加快，用t檢驗(yàn)方法分析，試藥組與對(duì)照組比較有顯著差異，原液組與外用溶

12、液空白溶液組比較也有明顯差異，表明rhGM-CSF外用溶液組與原液組對(duì)燙傷均有明顯的治療作用，外用溶液組較原液組效果好一些，說(shuō)明制劑組方的合理性。
　　 rhGM-CSF外用溶液對(duì)動(dòng)物皮膚急性毒性試驗(yàn)表明：各組家兔均活潑健康，飲食活動(dòng)等都未見異常。劑量已超過(guò)預(yù)計(jì)臨床用量的20倍以上。提示rhGM-CSF外用溶液對(duì)皮膚無(wú)毒副作用，臨床用藥安全。
　　 局部刺激性實(shí)驗(yàn)表明：給rhGM-CSF外用溶液和外用溶液空白溶液組動(dòng)物均

13、未出現(xiàn)明顯紅斑和水腫，表明rhGM-CSF外用溶液對(duì)皮膚為弱致敏性。觀察藥物對(duì)家兔皮膚多次給藥所產(chǎn)生的刺激反應(yīng)，受試家兔均未出現(xiàn)明顯紅斑和水腫（分值<0.5）表明rhGM-CSF外用溶液對(duì)家兔皮膚無(wú)刺激性。通過(guò)對(duì)動(dòng)物的皮膚過(guò)敏性試驗(yàn)、刺激性試驗(yàn)證明了rhGM-CSF外用溶液外用是安全的。
　　 結(jié)論：本課題研制的重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子外用溶液，以HZT.等為輔料，主要用于皮膚的燙傷、燒傷等疾病。充分發(fā)揮了生物制藥的優(yōu)勢(shì)具有