腺病毒介導(dǎo)的FIt3配體小鼠肝癌治療研究.pdf

1、第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文腺病毒介導(dǎo)的FIt3配體小鼠肝癌治療研究姓名：楊慶申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：肝膽外科學(xué)指導(dǎo)教師：楊廣順2001.5.1中文摘要FL是新發(fā)現(xiàn)的早期造血生長(zhǎng)因子，具有刺激機(jī)體造血和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的雙重作用。為了觀察肝癌局部FL基因轉(zhuǎn)移的抗腫瘤效果，本實(shí)驗(yàn)選擇重組腺病毒作為攜帶mFL的載體。首先，應(yīng)用高效細(xì)菌內(nèi)同源重組系統(tǒng)，構(gòu)建了攜帶mFL的重組腺病毒載體。PCR擴(kuò)增含有mFL的質(zhì)粒，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒，線性化后與腺病毒

2、骨架質(zhì)粒pAdEasy。1共轉(zhuǎn)化BJ5183大腸桿菌，并在其中發(fā)生同源重組，利用抗性的變化篩選重組腺病毒質(zhì)粒。Lipofectamine轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，重組腺病毒AdmFL在其中復(fù)制和擴(kuò)增，利用重組整合入腺病毒骨架中的綠色熒光蛋白(GFP)可以直接地觀察轉(zhuǎn)染與感染的效率。反復(fù)“感染收集凍融”，將108感染后的293細(xì)胞裂解上清CsCl梯度超速離心純化，測(cè)定AdmFL滴度為84x10IIefu／ml，空載體對(duì)照病毒為62x1011efu／

3、ml。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的腺病毒為下一步動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。一(體外分別以MOI為10、100、500的AdmFL感染小鼠肝癌細(xì)胞Hepal6，兩天后熒光顯微鏡下根據(jù)GFP的表達(dá)計(jì)算感染率分別是5％、60％和95％。體外以MOI為100的AdmFL對(duì)體外感染后的Hepal一6細(xì)胞無(wú)直接的生長(zhǎng)抑制作用。在感染后的Hepal6細(xì)胞內(nèi)RT—PCR擴(kuò)增到了mFL的mRNA，應(yīng)用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中mFL蛋白的濃度為80573ng／ml，證明腺病

4、毒能有效地感染靶細(xì)胞，并介導(dǎo)所攜帶mFL的高效表達(dá)。腫瘤內(nèi)注射1109efuAdmFL對(duì)C57BL／6小鼠肝癌有明顯的治療作用。建立小鼠的異位肝癌模型，分別腫瘤內(nèi)單次注射l109efuAdmFL、空病毒載體對(duì)照和PBS對(duì)照，觀察平均腫瘤大小和小鼠生存率。與對(duì)照相比，AdmFL能明顯地抑制腫瘤生長(zhǎng)，治療后37天89％(8／9)的小鼠腫瘤完全消退，并顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期。同時(shí)，AdmFL還能激發(fā)特異性免疫保護(hù)反應(yīng)，保護(hù)了100％(6／6