腺病毒介導的URG11RNAi抑制肝癌細胞生長及機制研究.pdf

1、URG11是利用抑制消減雜交及全長PCR擴增技術（RACE-PCR）克隆的一個可以被乙肝病毒X蛋白上調(diào)的新基因，編碼70KD蛋白質(zhì)。該蛋白含有2個VWFC結(jié)構域及一個C型凝集素結(jié)構域。VWFC結(jié)構域與細胞黏附、遷移、淋巴細胞的歸巢及信號轉(zhuǎn)導密切相關，而C型凝集素結(jié)構域參與細胞的增殖、分化。 前期研究表明，URG11在肝癌等惡性腫瘤中高表達，并與腫瘤惡性程度相關。 URG11還可促進腫瘤細胞增殖、分化，增強軟瓊脂克隆形成能

2、力及癌細胞裸鼠體內(nèi)成瘤能力，及通過上調(diào)β-橋連蛋白（β-catenin）的表達促進腫瘤細胞體外移動、黏附。另發(fā)現(xiàn)，它可增加細胞內(nèi)游離鈣離子濃度。 因此，URG11是一個和腫瘤惡性生物學行為密切相關并具有重要功能的新基因，但是否可作為肝癌治療，尤其腺病毒介導的基因治療新靶點，有待進一步闡明。 【目的】 利用URG11 及URG11-SiRNA 腺病毒進行肝癌基因治療實驗，闡明URG11對肝癌細胞惡性生物學行為的影響

3、，并初步探討相應的分子機制。 【方法】 1、構建URG11 及URG11-SiRNA 腺病毒載體；利用包裝的腺病毒感染URG11高表達的人肝癌細胞系HHCC 及URG11 低表達的QZG 細胞系，下調(diào)或上調(diào)其中URG11 蛋白表達水平，利用Western blot 方法進行檢測； 2、采用MTT 法繪制感染細胞的生長曲線，流式細胞術檢測感染細胞的凋亡及細胞周期分布情況； 3、進行裸鼠體內(nèi)成瘤實驗和基因治療

4、實驗，結(jié)合體外實驗，進一步驗證該基因功能； 4、進行雙向凝膠電泳等實驗，篩選URG11 促進肝癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的上下游分子。 【結(jié)果】 1、URG11 及URG11-SiRNA 腺病毒包裝及鑒定我們應用腺病毒載體購建試劑盒，成功構建并包裝了URG11 及URG11-SiRNA 腺病毒（Ad-CMV、Ad-pi0 為陰性對照），應用URG11-SiRNA 腺病毒感染肝癌細胞HHCC，經(jīng)Western Blot 實驗

5、證實，可以有效降低URG11 蛋白的表達水平，為下一步實驗奠定基礎。 2、腺病毒介導的URG11siRNA 抑制肝癌細胞體外增殖首先應用Western Blot 檢測三種肝癌細胞系HHCC、SMMC7721、HepG2及人永生化肝細胞QZG 中URG11 蛋白表達情況，證實該蛋白在四種細胞均有不同程度表達，其中HHCC 表達水平最高，而QZG 表達水平最低；URG11-SiRNA腺病毒感染肝癌細胞HHCC 后進行MTT 實驗發(fā)現(xiàn)

6、,URG11 蛋白表達水平下調(diào)明顯抑制了肝癌細胞的生長(P<0.05)；應用流式細胞術檢測感染后細胞凋亡和周期分布的變化，發(fā)現(xiàn)下調(diào)該基因能夠減少細胞G1-S 期阻滯并促進凋亡(P<0.05)；而URG11 腺病毒感染QZG 細胞可以促進細胞生長，造成細胞G1-S期阻滯并抑制凋亡(P<0.05)。 3、腺病毒介導的URG11siRNA 抑制肝癌細胞體內(nèi)成瘤體內(nèi)實驗顯示，用攜帶URG11-SiRNA 的腺病毒與肝癌細胞HHCC 細胞

7、混合后注射裸鼠，可以通過下調(diào)URG11 表達在一定程度上抑制HHCC 細胞裸鼠體內(nèi)成瘤能力；URG11-SiRNA 腺病毒直接注入瘤體，可以明顯減小腫瘤體積（P<0.05）。 4、URG11 上下游效應分子的篩選在相似條件下重復進行雙向凝膠電泳實驗，利用Melanie3 2-D 分析軟件分析，從蛋白雙向電泳圖譜中選取穩(wěn)定差異表達的、大小集中在20kd 至100kd之間的19 個蛋白質(zhì)斑點進行切割，經(jīng)過脫銀、蛋白酶消化后，進行飛行