鏈霉菌產(chǎn)生的(4S-R)-4,5-雙氫-4-羥基格爾德霉素及其他新次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)與探索.pdf

1、鏈霉菌能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)豐富、活性多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是創(chuàng)新微生物藥物的重要來源，因此對(duì)鏈霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行挖掘和探索對(duì)于創(chuàng)新微生物藥物研究非常重要。
　　本論文共分為兩個(gè)部分，其中第一部分為基于細(xì)胞色素P450催化機(jī)制從Streptomyces hygroscopicus17997中發(fā)現(xiàn)和鑒定格爾德霉素新組分，第二部分為鏈霉菌CPCC203471和CPCC200466產(chǎn)生的抗生素新組分的發(fā)現(xiàn)和探索。
　　格爾德霉素(gelda

2、namycin，GDM)是由吸水鏈霉菌產(chǎn)生的苯醌型安莎類抗生素，為熱休克蛋白Hsp90的特異性抑制劑，它的抗腫瘤細(xì)胞活性(IC5o)在亞微摩爾級(jí)。但GDM的肝毒性強(qiáng)、水溶性差，只能作為抗腫瘤藥物開發(fā)的先導(dǎo)化合物。目前已報(bào)道數(shù)百個(gè)GDM的有機(jī)半合成衍生物，其中多種衍生物具有較好的體內(nèi)活性，例如17-烯丙氨基-17-去甲氧基格爾德霉素（17-AAG）已針對(duì)多種腫瘤進(jìn)入了Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段。此外，許多天然GDM類似物不斷從GDM產(chǎn)生菌中被發(fā)現(xiàn)和

3、分離出來，它們中某些化合物的水溶性和抗腫瘤細(xì)胞活性優(yōu)于GDM，預(yù)示著天然GDM類似物也有成為潛在的抗腫瘤藥物可能。
　　GDM的生物合成分為前格爾德霉素形成和PKS后修飾兩部分。在PKS后修飾過程中有一個(gè)從碳碳單鍵到雙鍵的氧化脫氫（去飽和）步驟，催化這步反應(yīng)的酶GdmP屬于細(xì)胞色素P450超家族。細(xì)胞色素P450在生物體內(nèi)主要催化羥基化反應(yīng)，僅在極少數(shù)情況下催化去飽和反應(yīng)，因此這步催化反應(yīng)引起了我們的興趣:在催化去飽和反應(yīng)時(shí)是否也

4、有羥基化產(chǎn)物出現(xiàn)？依據(jù)文獻(xiàn)對(duì)細(xì)胞色素P450催化機(jī)制的一般性分析總結(jié)，以及我們對(duì)GdmP初步的生物信息學(xué)分析結(jié)果，推測(cè)在GdmP催化的C-4,5位去飽和反應(yīng)過程中也有可能出現(xiàn)羥基化產(chǎn)物。因此，發(fā)現(xiàn)該羥基化GDM類似物對(duì)于深入理解GDM生物合成具有重要作用，同時(shí)，對(duì)其抗腫瘤細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)定對(duì)于獲得具有開發(fā)前景的GDM衍生物具有實(shí)際意義。
　　吸水鏈霉菌17997（Streptomyces hygroscopicus17997）是中國(guó)

5、醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所分離鑒定的一株GDM產(chǎn)生菌。根據(jù)上面的推測(cè)，我們通過TLC和LC-MS/MS等方法對(duì)吸水鏈霉菌17997的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)預(yù)期的GDM新組分:化合物1和2。經(jīng)分離純化后，采用HRESIMS、IR、NMR及Mosher法等確定化合物1和2為一對(duì)差向異構(gòu)體，化學(xué)結(jié)構(gòu)分別為(4S)-4，5-雙氫-4-羥基格爾德霉素(1)和(4R)-4，5-雙氫-4-羥基格爾德霉素(2)?；衔?和2不能生物轉(zhuǎn)

6、化為GDM，因此它們不是GDM生物合成中的正常中間產(chǎn)物，而是GdmP催化出現(xiàn)的支路產(chǎn)物?；衔?和2的發(fā)現(xiàn)使得我們對(duì)GdmP在GDM生物合成中催化C-4，5位氧化脫氫的機(jī)制有了更加深入的認(rèn)識(shí)。
　　體外抗腫瘤細(xì)胞毒性測(cè)定表明:與GDM相比，(4S/R)-4，5-雙氫-4-羥基格爾德霉素的HepG2腫瘤細(xì)胞毒性降低約30倍。說明C-4位羥基化對(duì)GDM的活性有不利影響。
　　本論文第二部分對(duì)鏈霉菌CPCC203471和CPCC2

7、00466進(jìn)行了抗菌活性產(chǎn)物鑒定及抗生素新組分發(fā)現(xiàn)探索。鏈霉菌CPCC203471和CPCC200466是經(jīng)過對(duì)20余株不同來源的鏈霉菌進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生情況和活性情況初篩后選定的。這兩株菌次級(jí)代謝產(chǎn)物較為豐富且活性較好，值得進(jìn)一步研究。
　　CPCC203471是從滇西森林土壤中分離得到的一株鏈霉菌，通過TLC、LC-MS以及HRMS等方法對(duì)其脂溶性次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析，獲得其中的化合物的紫外-可見光吸收光譜、分子量和分子式

8、等信息后，檢索天然產(chǎn)物化合物庫(kù)及SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù)并查閱文獻(xiàn)，對(duì)化合物進(jìn)行排重，首先確定了CPCC203471產(chǎn)生的主要抗菌活性化合物為新生霉素(novobiocin)。隨后，從CPCC203471的脂溶性次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)新生霉素結(jié)構(gòu)類似物，其分子量分別為555(b)、642(d，NOV-642)、555(e)、569(f)、569(g)、598(i)。根據(jù)分子量信息，推測(cè)化合物b為4"-O-去甲基-3"-O-去氨甲?；?/p>

9、生霉素（4"-O-desmethyl-3"-O-descarbamoylnovobiocin）;化合物f、g為同分異構(gòu)體，其中一個(gè)可能為3"-O-去氨甲?；律顾?3"-O-descarbamoylnovobiocin)，另一個(gè)推測(cè)為天然的新生霉素新組分，由于產(chǎn)量較低留待后續(xù)研究;化合物i為4"-O-去甲基新生霉素(4"-O-desmethylno vobiocin);化合物d(NOV-642)為新生霉素新組分。經(jīng)分離純化和NMR結(jié)構(gòu)

10、解析，確定NOV-642為5-甲氧基新生霉素。
　　我們對(duì)NOV-642和新生霉素的抗菌活性(MIC)進(jìn)行了測(cè)定和對(duì)比，發(fā)現(xiàn)NOV-642比新生霉素的活性約降低了3-7倍。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，5-羥基新生霉素比新生霉素活性降低約40倍，這給新生霉素類似物構(gòu)效關(guān)系提供了新內(nèi)容:新生霉素C-5位的取代會(huì)降低化合物活性，取代基團(tuán)的極性越大活性降低越多。
　　已知新生霉素主要作用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，曾用于耐藥性金黃色葡萄球菌引起的感染，同時(shí)

11、新生霉素作為Hsp90 C-端抑制劑，還對(duì)多種癌細(xì)胞顯示抑制作用，并能與抗癌藥聯(lián)用、逆轉(zhuǎn)抗癌藥的耐藥性。因此，還需要對(duì)NOV-642進(jìn)行更多的生物活性測(cè)定與評(píng)價(jià)，以確定其是否具有藥物開發(fā)潛力。
　　此外，從CPCC203471的次級(jí)代謝產(chǎn)物中我們還發(fā)現(xiàn)了大環(huán)內(nèi)酰胺類化合物BE-14106(c)，文獻(xiàn)報(bào)道該化合物具有腫瘤細(xì)胞毒性。
　　CPCC200466是一株具有抗真菌活性的鏈霉菌。同樣通過TLC、LC-MS以及HRMS等方

12、法對(duì)該菌株的部分脂溶性次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析鑒定，得到了化合物的紫外-可見光吸收光譜數(shù)據(jù)和分子量、分子式等信息，通過檢索SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù)等并查閱文獻(xiàn)，對(duì)化合物進(jìn)行排重，確定CPCC200466的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物為噁唑霉素（oxazolomycin，OZM，化合物4），同時(shí)發(fā)現(xiàn)了與噁唑霉素分子量(655)相同的5個(gè)噁唑霉素小組分（化合物3、5、6、7、8），而目前文獻(xiàn)報(bào)道的分子量為655的噁唑霉素類化合物共3個(gè)，分別為噁唑霉素A(

13、4'Z，6'Z，8，E)、B(4'E，6'E，8'E)和C(4'Z，6'E，8，E)，三者互為幾何異構(gòu)體。由此推斷，CPCC200466中含有至少3個(gè)噁唑霉素新組分有待確證。
　　噁唑霉素結(jié)構(gòu)新穎，含有γ-內(nèi)酰胺螺β-內(nèi)酯環(huán)，噁唑環(huán)，(E，E)二烯和一個(gè)(Z，Z，E)三烯鏈，其中的γ-內(nèi)酰胺-螺β-內(nèi)酯環(huán)與處于臨床試驗(yàn)階段的抗腫瘤藥物salinosporamide A（20S蛋白酶抑制劑）的藥效團(tuán)相似。噁唑霉素具有抗菌、抗病毒和抗