鏈霉菌源次級代謝物的產(chǎn)生、分離和結(jié)構(gòu)鑒定.pdf

1、鏈霉菌源的次級代謝物是天然產(chǎn)物藥物的重要組成部分，所謂次級代謝是微生物在一定的生長時期（一般是穩(wěn)定生長期），以初級代謝產(chǎn)物為前體，合成一些對微生物的生命活動沒有明確功能的物質(zhì)的過程。以初級代謝小分子產(chǎn)物為反應底物，通過一系列特定的酶蛋白催化反應，即多個不同功能的酶依次作用，最終得到微生物次級代謝產(chǎn)物。通過微生物全基因測序和生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，微生物染色體中有許多小分子化合物的生物合成基因簇，而這些小分子化合物在微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)量很低或

2、者不產(chǎn)生，通過異源表達的方法可以發(fā)酵得到一些結(jié)構(gòu)新奇的小分子化合物或者使化合物產(chǎn)量得到提高，這有利于我們發(fā)現(xiàn)更多的新化合物。
　　 本課題共分為三個部分:1）鏈霉菌Streptomyces rochei ATCC10739發(fā)酵、次級代謝產(chǎn)物Borrelidin分離純化和結(jié)構(gòu)確證;2）鏈霉菌Streptomyces TP-A2060菌株中幾個小分子次級代謝產(chǎn)物基因簇的異源表達;3）鏈霉菌Streptomyces 371菌株中幾個小

3、分子次級代謝產(chǎn)物基因簇的異源表達。
　　 Borrelidin是從鏈霉菌(Streptomyces rochei ATCC10739)中分離到的一種18元大環(huán)內(nèi)酯抗生素，其具有CDK(依賴于細胞周期的蛋白激酶)抑制活性和抑制血管生成活性。我們的工作主要是優(yōu)化發(fā)酵條件并對化合物進行分離純化，對其結(jié)構(gòu)進行確證。在菌株發(fā)酵過程中對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以穩(wěn)定并提高化合物產(chǎn)量。最終確定了最適發(fā)酵條件:ISP-2培養(yǎng)基中添加1％甘油，起始pH

4、值為6.0，培養(yǎng)溫度30℃，相對濕度50％，發(fā)酵時間為7d?；衔锝?jīng)ESI-MS、HR-ESI-MS和1HNMR確證其結(jié)構(gòu)與文獻相符。
　　 Streptomyces TP-A2060是抗腫瘤抗生素Yatakemycin的產(chǎn)生菌，我們主要是對其中的幾個小分子化合物基因進行異源表達。由全基因測序和生物信息學分析可知，化合物主要包括五個萜類化合物、一個芳香族聚酮化合物、一個無法預知結(jié)構(gòu)類型的化合物。通過克隆質(zhì)粒、異源表達質(zhì)粒和突變株

5、的構(gòu)建，我們成功獲得了全部基因簇的異源表達質(zhì)粒、Tep-1和Tep-4的突變株，并對這兩個突變株進行了小量發(fā)酵。希望通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化得到其余突變株，最后發(fā)酵得到預期化合物。進一步的突變株構(gòu)建和發(fā)酵工作還在進行中。
　　 Streptomyces 371是生物農(nóng)藥金核霉素的產(chǎn)生菌，我們所做的工作主要是希望通過異源表達獲得可能的三個萜類化合物和一個芳香族聚酮化合物。目前已經(jīng)成功得到了全部基因簇的異源表達質(zhì)粒、Tep-7和Pkz的突變