鏈霉菌產(chǎn)生的除草霉素新組分發(fā)現(xiàn)及其他活性次級(jí)代謝產(chǎn)物研究.pdf

1、鏈霉菌具有產(chǎn)生豐富次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力，能夠產(chǎn)生多種化學(xué)結(jié)構(gòu)和多樣生理活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是微生物藥物重要來(lái)源。早期的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物主要是采用生物活性跟蹤的方法進(jìn)行發(fā)現(xiàn)，而化學(xué)篩選方法在系統(tǒng)挖掘鏈霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究中扮演了越來(lái)越重要的角色。
　　本論文共分為兩部分，第一部分是通過(guò)生物合成分析指導(dǎo)，利用微生物天然產(chǎn)物的化學(xué)篩選方法從吸水鏈霉菌Streptomyces sp.CPCC200291的次級(jí)代謝產(chǎn)物中挖掘到兩個(gè)新的除草

2、霉素類(lèi)似物;第二部分是鏈霉菌產(chǎn)生的醌霉素組分的鑒定以及其他鏈霉菌產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物線索。
　　除草霉素A(herbimycin A，HBM A)是由吸水鏈霉菌產(chǎn)生的苯醌型安莎類(lèi)抗生素，與格爾德霉素結(jié)構(gòu)類(lèi)似，也是熱休克蛋白Hsp90特異性抑制劑，具有顯著地抗腫瘤活性，是抗腫瘤藥物的先導(dǎo)化合物。研究除草霉素的類(lèi)似物，也有可能為抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)提供水溶性好、肝毒性低的先導(dǎo)化合物。
　　除草霉素的生物合成分為由Ⅰ型聚酮合酶催化（type

3、Ⅰ PKS）形成前體前格爾德霉素的過(guò)程，和PKS后修飾（post-PKS修飾）過(guò)程。Post-PKS修飾復(fù)雜，包括氨甲酰化、氧化、羥基化和氧甲基化等，其中任何一個(gè)步驟的中間產(chǎn)物都可能終止進(jìn)一步修飾而得以積累成為主組分的小組分類(lèi)似物或者成為支路產(chǎn)物，即抗生素的多組分現(xiàn)象。研究除草霉素的多組分有助于深入認(rèn)識(shí)除草霉素的生物合成機(jī)制，同時(shí)，還可能發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)前景的除草霉素衍生物。
　　吸水鏈霉菌CPCC200291（Strept

4、omyces sp.CPCC200291）是保藏于中國(guó)藥學(xué)微生物菌種保藏管理中心(China Pharmaceutical Culture Collection，CPCC)的一株鏈霉菌菌株。我們采用TLC顯色串聯(lián)HPLC和MS分析方法，早期快速鑒定該菌株為除草霉素產(chǎn)生菌，主組分為除草霉素A和C。對(duì)除草霉素生物合成分析，并結(jié)合TLC、HPLC和LC-MS等化學(xué)篩選方法對(duì)該菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)新的小組分類(lèi)似物:化合物

5、1和2。經(jīng)分離純化，利用HRESIMS、2D NMR、Mosher法等確定化合物1和2的結(jié)構(gòu)，化合物1為4，5-雙氫-(4S)-4-羥基除草霉素B，命名為除草霉素G(herbimycin G，HBM G)，化合物2為(15R)-15-羥基除草霉素B，命名為除草霉素H(herbimycin H，HBM H)。化合物1是除草霉素生物合成的支路產(chǎn)物，而化合物2是除草霉素生物合成的中間產(chǎn)物。
　　與除草霉素A相比，化合物1和2的體外抗腫瘤

6、細(xì)胞活性比除草霉素A低，水溶性比除草霉素A提高了近20倍。
　　中國(guó)藥學(xué)微生物菌種保藏管理中心具有豐富的菌種資源，我們對(duì)該中心保存的、產(chǎn)物未被鑒定的近三十株鏈霉菌進(jìn)行產(chǎn)物鑒定，尋找活性好、有開(kāi)發(fā)價(jià)值的鏈霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物。
　　本論文第二部分是利用TLC、HPLC、LC-MS等化學(xué)篩選方法對(duì)鏈霉菌CPCC200497和CPCC204110(I10A-00954)的脂溶性次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，并結(jié)合HRESIMS和NMR數(shù)據(jù)，綜

7、合分析獲得的化合物UV-Vis數(shù)據(jù)、分子量信息等，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，確定化合物類(lèi)型;以及在鑒定CPCC200497為醌霉素產(chǎn)生菌的基礎(chǔ)上，對(duì)四株醌霉素產(chǎn)生菌CPCC200239、CPCC200240、CPCC200299和CPCC200497進(jìn)行醌霉素組分和產(chǎn)量的初步比較。
　　首先，鏈霉菌CPCC200497是從廣西省土壤中分離、并保存的一株具有抗病毒活性菌株，我們經(jīng)過(guò)對(duì)鏈霉菌CPCC200497產(chǎn)物跟蹤發(fā)酵，對(duì)其產(chǎn)生的豐富次級(jí)代謝

8、產(chǎn)物研究分析，鑒定主產(chǎn)物為醌霉素(quinomycin)A、B和C組分。對(duì)經(jīng)分離純化得到醌霉素A和C組分進(jìn)行體外抗菌活性(MIC)測(cè)定顯示，醌霉素A和C具有顯著的抗革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌菌株活性，對(duì)MRS和VRE耐藥菌株具有非常低的MIC值，優(yōu)于萬(wàn)古霉素和克拉霉素。
　　醌霉素是酯肽類(lèi)抗生素，分子結(jié)構(gòu)中帶有兩個(gè)特征發(fā)色團(tuán)，屬喹喔啉抗生素家族，通過(guò)發(fā)色團(tuán)嵌入DNA分子干擾細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，因而具有抗細(xì)菌、抗病毒和細(xì)胞毒活性，曾經(jīng)作為抗腫瘤藥物

9、進(jìn)入Ⅱ期臨床研究，但并沒(méi)有顯現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性。結(jié)合本文研究結(jié)果，有必要對(duì)醌霉素的用途進(jìn)行再認(rèn)識(shí)和評(píng)價(jià)，例如考慮通過(guò)化學(xué)修飾改造，適當(dāng)降低細(xì)胞毒性，將其作為抗耐藥菌感染的化合物進(jìn)行深入研究。對(duì)于已知抗生素的再認(rèn)識(shí)和評(píng)價(jià)，也是創(chuàng)新藥物研究的重要內(nèi)容。CPCC200497可作為實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)菌株，為改造醌霉素研究提供原料。
　　其次，鏈霉菌CPCC204110(I10A-00954)分離自青海省土壤樣品，我們?cè)谄渲苄源渭?jí)代謝產(chǎn)物中，發(fā)

10、現(xiàn)一組UV-Vis吸收峰形類(lèi)似，HPLC出峰特點(diǎn)和LC-MS分子量具有一定規(guī)律的化合物，綜合分析以及數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，推測(cè)該菌是阿霉素（doxorubicin，DOX或adriamycin）產(chǎn)生菌，在該脂溶性的發(fā)酵液中的主要化合物是阿霉素乙?；a(chǎn)物。阿霉素是細(xì)胞周期非特異性抑制劑，通過(guò)葸環(huán)平面插入DNA，并且是拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的抑制劑，干擾復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，是目前腫瘤化療的一線用藥。
　　鏈霉菌CPCC200239、CPCC200240和CPCC

11、200299是中國(guó)藥學(xué)微生物菌種保藏中心保藏的三株醌霉素產(chǎn)生菌。我們初步比較了這三株菌與CPCC200497在醌霉素產(chǎn)生水平與組分上的差異。結(jié)果如下:CPCC200239和CPCC200240只產(chǎn)生醌霉素A，前者產(chǎn)量明顯低于后者，且CPCC200240和CPCC200497產(chǎn)量相當(dāng);CPCC200299是醌霉素A和C的產(chǎn)生菌，產(chǎn)量均居中;只有CPCC200497產(chǎn)生少量的醌霉素B。
　　菌株CPCC200240的次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富，