不同強度靜水壓力對人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、研究背景:
　　骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的慢性關(guān)節(jié)疾病,好發(fā)于負(fù)重較大的膝關(guān)節(jié)等部位,是由于多種機械性和生物性因素相互作用所致,其具體的病因和發(fā)病機制目前尚不明確。膝關(guān)節(jié)是人體最復(fù)雜也是最大的關(guān)節(jié),對人體下肢運動和載荷支撐起著非常重要的作用,關(guān)節(jié)軟骨作為關(guān)節(jié)的重要組成部分,與人的其它體細(xì)胞相比,處于關(guān)節(jié)內(nèi)特殊的壓力環(huán)境之中,具有獨特的結(jié)構(gòu)與力學(xué)特性,致使其代謝和功能也必然受到壓力的影響和調(diào)控。許多骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的動物模型也證實了骨關(guān)節(jié)炎的

2、疾病進展過程與壓力密切相關(guān),尤其是靜水壓力對軟骨新陳代謝的影響。Ⅱ型膠原、IL-1β、TNF-α、MMP-13作為與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展具有高度相關(guān)性的細(xì)胞因子和蛋白,若能證明其在壓應(yīng)力與骨關(guān)節(jié)炎疾病間具有紐帶作用,則對研究關(guān)節(jié)壓應(yīng)力與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病和進展的相關(guān)性具有重要意義。
　　研究目的:
　　本研究擬建立一個理想的人軟骨細(xì)胞壓力實驗?zāi)Ｐ?以更好的模擬人承重關(guān)節(jié)內(nèi)部的壓力環(huán)境,為進一步研究壓力對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞影響的奠定實驗基礎(chǔ)

3、。通過高強度靜水壓力實驗,試從細(xì)胞學(xué)層面探討高強度壓力與人關(guān)節(jié)軟骨退變、骨關(guān)節(jié)炎之間的關(guān)系。
　　研究方法:
　　1.通過臨床上獲得的正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織和骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織,經(jīng)兩步酶消化法獲取原代正常軟骨細(xì)胞和骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞,傳代并觀察;甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色鑒定軟骨細(xì)胞;基于自行設(shè)計的多功能恒溫體外細(xì)胞培養(yǎng)中高壓靜水壓力加載裝置建立人軟骨細(xì)胞壓力實驗?zāi)Ｐ汀?br>　　2.通過多功能恒溫體外細(xì)胞培養(yǎng)中高壓靜水壓力

4、加載裝置對實驗組軟骨細(xì)胞分別施加3.0MPa、7.0MPa、10.0MPa的靜水壓力,每天加壓培養(yǎng)2h,共5d;通過CCK-8、MTT、流式細(xì)胞儀檢測軟骨細(xì)胞經(jīng)不同壓力處理后的增殖和凋亡情況;根據(jù)壓力實驗數(shù)據(jù)對建立的人軟骨細(xì)胞壓力實驗?zāi)Ｐ瓦M行評估。
　　3.通過多功能恒溫體外細(xì)胞培養(yǎng)中高壓靜水壓力加載裝置分別對正常軟骨細(xì)胞組和骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組施加10.0MPa靜水壓力,每天加壓培養(yǎng)2h,共5d;通過qRT-PCR和Western

5、-Blot檢測壓力處理后各組軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原、IL-1β、TNF-α和MMP-13的分泌和表達情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.通過原代培養(yǎng)從臨床上獲得的活力較高的膝關(guān)節(jié)正常軟骨細(xì)胞和病變明顯的膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞,其更符合人類的生物學(xué)特點。多功能恒溫體外細(xì)胞培養(yǎng)中高壓靜水壓力加載裝置能有效模擬生理情況下人膝關(guān)節(jié)內(nèi)的靜水壓力負(fù)荷。
　　2.CCK-8、MTT、流式細(xì)胞儀檢測顯示,與對照組相比,3.0MPa壓力能促進軟

6、骨細(xì)胞增殖,抑制凋亡;7.0MPa壓力可致軟骨細(xì)胞增殖能力的下降和細(xì)胞凋亡率升高;10.0MPa壓力導(dǎo)致軟骨細(xì)胞增殖能力的大幅下降和明顯的細(xì)胞凋亡趨勢。人軟骨細(xì)胞壓力實驗?zāi)Ｐ徒?jīng)實驗評估,證實其性能穩(wěn)定、安全可靠、可重復(fù)性強,可以有效的模擬人關(guān)節(jié)內(nèi)的壓力環(huán)境。
　　3.qRT-PCR和Western-Blot檢測結(jié)果顯示:正常軟骨細(xì)胞或骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞經(jīng)高強度靜水壓力作用后,都表現(xiàn)出對Ⅱ型膠原表達的抑制,和對IL-1β、TNF-α和

7、MMP-13表達的促進作用;經(jīng)高強度靜水壓力作用后,骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞與正常軟骨細(xì)胞相比,Ⅱ型膠原的表達下降,MMP-13和IL-1β的表達升高,而TNF-α的表達差異不明顯。
　　結(jié)論:
　　1.本研究從臨床上獲取人膝關(guān)節(jié)軟骨組織,通過原代培養(yǎng),獲得活力較高的膝關(guān)節(jié)正常軟骨細(xì)胞和病變明顯的膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞,其更符合人類關(guān)節(jié)內(nèi)的生物學(xué)特點,研究結(jié)果可信度更高。建立的人軟骨細(xì)胞壓力實驗?zāi)Ｐ透N近人類,可以更好的模擬人承重關(guān)

8、節(jié)內(nèi)部的壓力環(huán)境,較動物模型更具優(yōu)勢。
　　2.利用本壓力實驗?zāi)Ｐ?初步確定了人軟骨細(xì)胞壓力實驗中的壓力梯度選擇,證實了不同強度的靜水壓力對人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡會產(chǎn)生不同的影響。經(jīng)過實驗評估,證明此壓力模型可以安全穩(wěn)定的向培養(yǎng)的細(xì)胞施加靜水壓力,用于各類靜水壓力影響相關(guān)的實驗。
　　3.超過生理水平的高強度靜水壓力不僅可直接影響軟骨細(xì)胞新陳代謝,造成細(xì)胞損傷,引起細(xì)胞凋亡,還能通過抑制Ⅱ型膠原合成,促進IL-1β、T