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文檔簡(jiǎn)介
1、羊傳染性膿皰病(Orf),俗稱羊口瘡,是由羊口瘡病毒(orf virus,ORFV)感染引起的一種急性接觸性傳染病。主要感染山羊和綿羊,典型特征為患羊口鼻等處粘膜和皮膚形成紅斑、潰瘍、丘疹、膿瘡和疣狀厚痂。本病常呈群發(fā)性流行,最易感染3~6月齡的羔羊。目前,該病在美洲、歐洲、非洲等一些主要養(yǎng)羊國(guó)家廣為分布,嚴(yán)重威脅著世界養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展和人類的健康,是羊的主要疫病之一。在我國(guó)東北、西北、西南等地區(qū)的吉林、黑龍江、青海、新疆、內(nèi)蒙等省,Orf
2、也均有不同程度的爆發(fā),其中一些地區(qū)非常嚴(yán)重,制約了我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。該病毒的抵抗力強(qiáng),羊群一旦被感染則很難清除且可持續(xù)危害羊群多年,給畜牧業(yè)造成一定的危害。
羊口瘡病毒(orf virus,ORFV)屬痘病毒科副痘病毒屬,是該屬的代表種。是已知的病毒顆粒體積較大的雙鏈DNA病毒。電鏡下,該病毒呈磚形或卵圓形,病毒表面呈繩索樣縱橫交錯(cuò)排列結(jié)構(gòu)。且病毒顆粒結(jié)構(gòu)復(fù)雜,有核心、側(cè)體和包膜。病毒基因組全長(zhǎng)大約138kb,GC含量高達(dá)64
3、%,推測(cè)其含有132個(gè)基因。基因組兩端的基因(ORF001-008,ORF112-134)變異較大,編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白;而在基因組中部的基因(ORF009-ORFV111)則很保守,對(duì)病毒復(fù)制、裝配和形態(tài)發(fā)生過(guò)程起關(guān)鍵作用。目前關(guān)于ORFV病毒的復(fù)制、裝配、形態(tài)發(fā)生及免疫機(jī)制的研究較少。
我們實(shí)驗(yàn)室的前期研究已獲得了一株單克隆抗體5F2D8,經(jīng)免疫沉淀及質(zhì)譜鑒定,發(fā)現(xiàn)該抗體能夠特異性識(shí)別ORFV086蛋白。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),O
4、RFV086基因位于病毒基因組的中間區(qū)域,為高度保守的基因,推測(cè)其在病毒的復(fù)制、裝配和形態(tài)發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用。
對(duì)不同的ORFV病毒株分析顯示,ORFV086基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)病毒粒子核心,并且該蛋白與痘苗病毒P4a蛋白及其他痘病毒同系物結(jié)構(gòu)相似。在痘苗病毒中,P4a蛋白大約占病毒粒子干重的14%,為病毒含量最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白。其由A10L基因編碼,在病毒感染晚期形成,大小約102kDa,之后在GGA和GGS位點(diǎn)發(fā)
5、生蛋白水解形成大小分別為62kDa、23kDa、9kDa的三個(gè)片段。這一蛋白水解過(guò)程對(duì)痘苗病毒子代粒子的裝配,形態(tài)發(fā)生和成熟有著重要的作用。且核心蛋白形態(tài)發(fā)生的蛋白水解只發(fā)生在未成熟病毒(Ⅳ)向細(xì)胞內(nèi)成熟病毒(IMV)的轉(zhuǎn)變過(guò)程中,使得球形的Ⅳ變?yōu)榇u形的IMV。目前認(rèn)為,在感染性病毒粒子裝配過(guò)程中,核心蛋白的水解加工是病毒成熟過(guò)程中的一種普遍現(xiàn)象。對(duì)于痘苗病毒(vaccinia virus,VV),核心蛋白發(fā)生蛋白水解的特點(diǎn)是:(1)含
6、有一個(gè)AGX模體;(2)在該病毒感染晚期表達(dá);(3)包裝入裝配的病毒粒子,組成病毒粒子核心。負(fù)責(zé)病毒蛋白水解加工的蛋白酶通常由病毒自身編碼。其他DNA病毒,例如腺病毒和非洲豬瘟病毒的復(fù)制及形態(tài)發(fā)生過(guò)程中,病毒核心蛋白也發(fā)生了特異性蛋白水解。與VV病毒核心蛋白發(fā)生水解的AGX膜體不同,腺病毒核心蛋白發(fā)生水解的位點(diǎn)是Gly-Gly-X膜體。同樣地,非洲豬瘟病毒的三個(gè)核心蛋白也是在Gly-Gly-X膜體發(fā)生蛋白水解。病毒核心蛋白發(fā)生蛋白水解已
7、經(jīng)成為許多DNA病毒和RNA病毒復(fù)制周期中的一種普遍現(xiàn)象。
NA1/11株的ORFV086基因全長(zhǎng)2718bp,編碼的ORFV086蛋白大小為100.05 kDa。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),ORFV086蛋白與痘苗病毒P4a蛋白及其他痘病毒同系物結(jié)構(gòu)相似。ORFV086蛋白是否具有類似于VV P4a蛋白的蛋白水解現(xiàn)象?目前還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究的目的是鑒定ORFV086蛋白的水解位點(diǎn)及其蛋白水解的分子特性,為了解ORFV的復(fù)制、裝配
8、、形態(tài)發(fā)生及成熟過(guò)程奠定基礎(chǔ)。
通過(guò)基因克隆技術(shù),成功構(gòu)建并原核表達(dá)了重組的ORFV086全長(zhǎng)蛋白,免疫兔子制備ORFV086多克隆抗體。該多克隆抗體能應(yīng)用于ORFV086蛋白的檢測(cè),從而為ORFV086蛋白的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。
通過(guò)氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析,預(yù)測(cè)ORFV086蛋白可能的水解位點(diǎn)。結(jié)果顯示,ORFV086為一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)蛋白,與P4a蛋白的AGS及AGT水解位點(diǎn)不同,其預(yù)測(cè)的蛋白水解位點(diǎn)為
9、GGA,GGS。對(duì)ORFV086全長(zhǎng)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行AGX膜體檢索,發(fā)現(xiàn)AGP,AGK及AGL均是AGX膜體,這五個(gè)位點(diǎn)都有可能是ORFV086蛋白的水解位點(diǎn)。根據(jù)所預(yù)測(cè)水解位點(diǎn)位置,通過(guò)基因克隆技術(shù)成功構(gòu)建了含ORFV086全長(zhǎng)或不同大小ORFV086片段的12個(gè)重組質(zhì)粒。
為確定ORFV086蛋白水解位點(diǎn)的位置,將N端或C端帶有flag標(biāo)簽的12個(gè)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染OFTU細(xì)胞,加入NA1/11病毒進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn),通過(guò)Fl
10、ag抗體以及ORFV086多克隆抗體檢測(cè)ORFV086蛋白的水解條帶。經(jīng)Flag抗體分析發(fā)現(xiàn),在加入ORFV后,2B-086,2B-N-GGS以及2B-N-GGA均可以檢測(cè)到兩條大小分別為45kDa,25kDa的特異性條帶,因其是N端帶有flag標(biāo)簽,可推測(cè)其水解位點(diǎn)均位于N-GGA之間。然而,2B-GGA-C以及2B-GGS-C均沒(méi)有檢測(cè)到除目的條帶以外的其他水解條帶。進(jìn)一步的ORFV086多克隆抗體分析發(fā)現(xiàn),加入 ORFV后,2B-
11、086,2B-N-GGS,2B-N-GGA,2B-GGA-C,2B-GGS-C,2B-GGA-GGS均可以檢測(cè)到5條大小分別為100kDa,33kDa,30kDa,25kDa以及21kDa的條帶。有趣的是,2B-GGS-C加入ORFV后還能特異性識(shí)別一條大小約23kDa條帶,且該23kDa條帶的大小與位置都與2B-GGS-C重組蛋白一致,這表明該23kDa條帶很有可能就是2B-GGS-C。
C端帶有flag標(biāo)簽的重組質(zhì)粒經(jīng)Fl
12、ag抗體分析,加入ORFV后,4A-086及4A-GGA-C檢測(cè)到一條約23kDa的特異性條帶,推測(cè)該23kDa條帶是在GGS位點(diǎn)水解形成的4A-GGS-C。4A-N-GGS和4A-N-GGA加入ORFV后檢測(cè)到一條45kDa特異性條帶,推測(cè)該45kDa條帶的水解位點(diǎn)位于N-GGA之間。4A-GGS-C沒(méi)有看到除目的條帶以外的其他水解片段。進(jìn)一步ORFV086多克隆抗體分析發(fā)現(xiàn),加入 ORFV后,4A-086,4A-N-GGS,4A-N
13、-GGA,4A-GGA-C,4A-GGS-C,4A-GGA-GGS均可以檢測(cè)到5條大小分別為100kDa,33kDa,30kDa,25kDa以及21kDa的條帶。有趣的是,4A-086,4A-GGA-C及4A-GGS-C在加入ORFV后,用ORFV086多克隆抗體能特異性識(shí)別一條23kDa條帶,并且該23kDa條帶大小與位置都與4A-GGS-C重組蛋白一致。這表明該23kDa條帶很有可能就是4A-GGS-C。4A-GGS-C+ORFV中
14、的23kDa條帶是真核表達(dá)的重組蛋白4A-GGS-C。然而,4A-086+ORFV和4A-GGA-C+ORFV分別轉(zhuǎn)染的是4A-086和4A-GGA-C重組質(zhì)粒,重組蛋白應(yīng)該分別只有4A-086和4A-GGA-C,那么在加入ORFV后,4A-086和4A-GGA-C出現(xiàn)的23kDa條帶就很有可能是在GGS位點(diǎn)水解形成的4A-GGS-C片段,并且這與用flag抗體檢測(cè)的結(jié)果是一致的。以上結(jié)果表明ORFV086在GGS位點(diǎn)發(fā)生了水解作用。<
15、br> 為進(jìn)一步確定23kDa條帶的水解位點(diǎn),我們分別將4A-086全長(zhǎng)中的AGP,AGK,AGL,GGA和GGS位點(diǎn)突變?yōu)镮DI。構(gòu)建的突變體分別轉(zhuǎn)染OFTu細(xì)胞,比較加入ORFV組與未加ORFV組的條帶差異。經(jīng)Flag抗體和ORFV086多克隆抗體分析發(fā)現(xiàn),加入ORFV病毒后,除將GGS位點(diǎn)突變?yōu)镮DI的突變質(zhì)粒4A-GGS-IDI沒(méi)有檢測(cè)到23kDa的條帶外,其他突變體和4A-086均能檢測(cè)到該23kDa條帶。這說(shuō)明23kDa條
16、帶是ORFV086在GGS位點(diǎn)進(jìn)行蛋白水解后形成的產(chǎn)物4A-GGS-C。以上結(jié)果進(jìn)一步表明ORFV086在GGS位點(diǎn)發(fā)生了蛋白水解作用。
進(jìn)一步對(duì)ORFV086蛋白進(jìn)行非放射性pulse-chase分析,結(jié)果顯示,21kDa條帶為ORFV086蛋白的一個(gè)水解產(chǎn)物;23kDa條帶為4A-086蛋白的一個(gè)水解產(chǎn)物。這也進(jìn)一步證實(shí)4A-086在GGS位點(diǎn)發(fā)生了蛋白水解,水解形成產(chǎn)物4A-GGS-C大小為23kDa。值得注意的是,在c
17、hase標(biāo)記蛋白中,還可以檢測(cè)到ORFV086全長(zhǎng)和4A-086全長(zhǎng)蛋白,這表明ORFV086蛋白或者4A-086蛋白均沒(méi)有完全發(fā)生蛋白水解,也即只有一部分的全長(zhǎng)蛋白發(fā)生蛋白水解。這與前面推測(cè)ORFV086全長(zhǎng)及其21kDa水解蛋白都是組成ORFV成熟病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白是相符的。
通過(guò)以上研究,對(duì)ORFV086蛋白水解的特性進(jìn)行了鑒定。ORFV086基因?yàn)橥砥诒磉_(dá)基因。ORFV086蛋白在GGS位點(diǎn)處進(jìn)行了不完全水解,形成產(chǎn)物
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