人乳頭瘤病毒16型(HPV16)藥物篩選模型的建立及藥效學評價.pdf

1、宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居女性腫瘤的第二位，是全球最主要的癌癥之一。流行病學顯示，持續(xù)性感染高危型人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是宮頸癌最重要的致病因素。約95％宮頸癌活組織檢查均檢測出有HPV的感染，證實了人乳頭瘤病毒(HPV)感染與宮頸癌密切相關(guān)。大約有50%和20%的宮頸癌病例分別檢測出高危型的HPV16和18，這兩種基因型的HPV在宮頸癌中的感染率最高。因此，大多數(shù)研究主

2、要是集中在HPV16和18的生物學研究上。在目前HPV治療性疫苗沒有取得突破性的進展，預防性疫苗僅適用于部分人群的情況下，治療性藥物的研究和開發(fā)仍然顯得很重要。而在藥物研發(fā)的最初階段，關(guān)鍵在于能否建立穩(wěn)定，快速，有效的藥物篩選模型并加以應用。本課題主要研究的目的是建立抗HPV16藥物的篩選模型，用于抗HPV16藥物的發(fā)現(xiàn)。
　　 采用HPV16陽性細胞Caski，以HPV16E6，E7基因為靶點，β-actin為內(nèi)參基因，提取細

3、胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行Real-timePCR，通過擴增曲線和溶解曲線，最終確定PCR反應條件和特異性E6，E7，β-actin引物，建立篩選抗HPV16候選物的Real-timePCR方法。
　　 以抗病毒藥物西多福韋(CDV)作為Caski細胞模型的陽性對照藥物。CDV處理Caski細胞,48h后提取細胞內(nèi)的總RNA，通過Real-timePCR檢測E6，E7在基因水平上的變化。CDV對Ca

4、ski細胞HPV16E6mRNA表達的抑制呈劑量依賴效應，125μg/ml和41.67μg/ml的CDV對Caski細胞HPV16E6mRNA抑制率分別為54.10%和50.27%，對E7mRNA抑制率分別為47.97%和52.75%。
　　 通過Caski細胞模型對50余個化合物和化學復方制劑進行篩選，得到了具有抗HPV16活性的陽性化合物L90512-2。
　　 受試化合物L90512-2處理Caski細胞48h后，

5、提取細胞內(nèi)的總RNA，最后進行Real-timePCR。化合物L90512-2對Caski細胞HPV16E6mRNA表達的抑制呈劑量依賴效應，濃度為40μg/ml的L90512-2對Caski細胞HPV16E6和E7mRNA的表達有下調(diào)作用，抑制率分別為72.6%和77.06%。western-blotting的結(jié)果顯示濃度為40μg/ml的L90512-2對Caski細胞HPV16E6蛋白表達有下調(diào)作用，抑制率達71%。并且濃度為40

6、μg/ml，20μg/ml，10μg/ml,5μg/ml的L90512-2對Caski細胞HPV16E7蛋白的表達均有下調(diào)作用，抑制率分別為82%，81%，77%，66%。
　　 另外初步探討了化合物L90512-2對腫瘤抑制因子p53和pRb蛋白的影響。40μg/ml的L90512-2能夠提高Caski細胞內(nèi)的p53和pRb蛋白的表達?；衔風90512-2僅僅是通過降低E6，E7蛋白水平從而間接提高細胞內(nèi)的p53和pRb蛋白

7、水平或者是還通過其他機制來提高p53和pRb蛋白的表達，還需進一步的深入研究。
　　 采用含HPV16病毒結(jié)構(gòu)蛋白L1和L2基因的表達質(zhì)粒和含GFP基因的報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T17細胞的方法成功制備了HPV16假病毒，并且建立了HPV16假病毒的細胞感染模型。將HPV16假病毒細胞感染模型作為篩選模型，得到了具有抗HPV16活性的復方高效碘，熒光檢測結(jié)果和western-blotting結(jié)果均顯示復方高效碘在濃度為1/24原液時

8、有較好的抑制病毒入胞的作用。
　　 初步建立了以GFP為報告基因的HPV16假病毒小鼠模型，并且采用該模型對復方高效碘的乳膏劑抗HPV16作用進行了初步研究，結(jié)果顯示其具有抑制HPV16感染小鼠陰道上皮細胞的作用。但由于存在較大的背景熒光，今后還應對假病毒小鼠模型的試驗條件進一步優(yōu)化，提高其實用性。
　　 宮頸癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位居第二位，已證持續(xù)性感染實高危型人乳頭瘤病毒(HPV)是誘發(fā)宮頸癌的主要因素，約95