人乳頭瘤病毒16型E7病毒癌基因干擾細(xì)胞周期調(diào)控與宮頸癌關(guān)系的研究——攜帶HPV16 E7癌基因重組腺病毒基因組的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、　　目的:構(gòu)建人乳頭瘤病毒16型(HPV16)E7病毒癌基因的重組腺病毒基因組，為重組腺病毒的包裝打好基礎(chǔ)，用于深入探討E7干擾細(xì)胞周期調(diào)控的研究。　　方法:①采用氯仿-異戊醇抽提法提取臨床證實(shí)為宮頸癌組織的DNA，PCR方法對(duì)所提DNA進(jìn)行HPV16E7基因的篩選；②DNAStar軟件輔助設(shè)計(jì)擴(kuò)增HPV16E7基因全長(zhǎng)片段的引物，并在其3'和5'端分別引入BglⅡ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的，PCR技術(shù)從HPV16E7陽性的宮頸癌組織中獲

2、得目的基因片段；③構(gòu)建攜帶目的基因(E7基因全長(zhǎng)片段)的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-E7；④限制性內(nèi)切酶PmeⅠ線性化重組穿梭質(zhì)粒，并用堿性磷酸酶去磷酸化處理后，QIAquickPCRPurificationKit進(jìn)行酶切產(chǎn)物的純化；⑤采用1×TSS兩步法將腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1轉(zhuǎn)化E.coliBJ5183宿主菌，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并鑒定；⑥將線性化的pAdTrack-CMV-E7轉(zhuǎn)化新鮮制備的E.coliBJ5

3、183感受態(tài)細(xì)菌(含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1)，利用RecA+宿主菌內(nèi)的同源重組系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒基因組；⑦篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒并鑒定Ad-E7。　　結(jié)論:①采用PCR技術(shù)可以從HPV16E7陽性的宮頸癌組織DNA中擴(kuò)增出E7病毒癌基因全長(zhǎng)片段。②通過分子克隆技術(shù)可以構(gòu)建攜帶HPV16E7病毒癌基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-E7。③利用高效的1×TSS兩步轉(zhuǎn)化法可以制備含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的