人乳頭瘤病毒16型晚期蛋白L1預(yù)防性疫苗的研究.pdf

1、人乳頭瘤病毒(HPV)感染屬于嚴(yán)重的性傳播疾病，給人類健康帶來很大的影響，臨床學(xué)、分子生物學(xué)和流行病學(xué)調(diào)查已經(jīng)證明人乳頭瘤病毒是宮頸癌的主要病因，并且隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的應(yīng)用不斷進(jìn)步，預(yù)防和治療宮頸癌的疫苗倍受許多科學(xué)家的重視。因此，此項(xiàng)疫苗的研究具有非常重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。 目前大多數(shù)關(guān)于HPV疫苗的研究都是以其晚期蛋白L1或L1+L2 所形成的病毒樣顆粒(VLPs)為基礎(chǔ)進(jìn)行的，在本實(shí)驗(yàn)中

2、，我們應(yīng)用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)開展了基因工程 HPV16L1 預(yù)防性疫苗的研究工作，取得了一些進(jìn)展，為該疫苗的進(jìn)一步發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)期間主要得到了以下幾個(gè)方面的結(jié)果： 1)搜索Genebank 中有關(guān)HPV16L1 的基因序列，共搜索到30 條較完整的序列，用軟件 AlignX 進(jìn)行序列比對(duì)，確定同源性最大的氨基酸序列，再根據(jù)畢赤酵母密碼子進(jìn)行優(yōu)化，送上海生工合成，但三個(gè)月后送來兩個(gè)片段，兩片段間有一段重復(fù)序列(其中都含有 Bg

3、lⅡ的酶切位點(diǎn))，將兩個(gè)片段分別酶切后通過 BglⅡ進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，將其產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，合成了全長為 1536bp 的 HPV16L1 基因。 2)構(gòu)建了酵母重組質(zhì)粒 pAO819-16L1，經(jīng)酶切鑒定正確后通過電擊轉(zhuǎn)化到酵母菌株 GS115 中，經(jīng) G418 抗性篩選獲高拷貝工程菌并用甲醇(1％)誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)，每隔 24h 補(bǔ)加甲醇1％，在誘導(dǎo)后48h、72h 和 96h 收菌，用 Wester

4、n Blot鑒定現(xiàn)在55KD 處出現(xiàn)特異性的條帶，而陰性對(duì)照中未出現(xiàn)目的條帶，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后72h表達(dá)量最高。 3)構(gòu)建原核重組質(zhì)粒 pET43.1a-16L1，經(jīng)酶切鑒定正確后轉(zhuǎn)化至 BL21 codonplus(DE3)和BL21 cedonPlus(DE3)-RILP 菌株中進(jìn)行表達(dá)，目的蛋白以包涵體的形式存在，通過8M尿素變性處理后過離子交換樹脂，分階段進(jìn)行洗脫，0.1MNaCl可洗脫雜蛋白，0.5MNaCl 可洗脫目的蛋白