兩個(gè)視網(wǎng)膜色素變性家系的分子遺傳學(xué)研究.pdf

1、視網(wǎng)膜色素變性是一類遺傳性視網(wǎng)膜疾病，世界范圍內(nèi)平均約有1/3500的患病率，是成年人失明的主要原因之一。視網(wǎng)膜色素變性患者通常在早期出現(xiàn)夜盲，漸行性視野喪失；到末期階段，往往在中年之后，患者的中心視野嚴(yán)重受損時(shí)，可導(dǎo)致永久性失明。眼底檢查中通常可見視網(wǎng)膜血管變細(xì)，眼底分布有色素沉著，視盤呈蒼白色等典型特征。目前，臨床上對視網(wǎng)膜色素變性尚沒有有效的預(yù)防與治療方法。
　　 視網(wǎng)膜色素變性表現(xiàn)出高度的臨床以及遺傳異質(zhì)性。遺傳上，主要

2、可表現(xiàn)為常染色體顯性（30-40%），常染色體隱性（50-60%），X 染色體連鎖（5-15%）等三種方式的遺傳，少數(shù)視網(wǎng)膜色素變性的病例不屬于孟德爾遺傳模式，如雙基因遺傳以及線粒體遺傳等。有些基因的不同突變，在不同的家系中還可以表現(xiàn)為不同的遺傳模式。雖然已經(jīng)有很多相關(guān)基因或位點(diǎn)被報(bào)道，但是，迄今為止，仍然有60%的視網(wǎng)膜色素變性病例沒有找到致病基因。發(fā)現(xiàn)新的視網(wǎng)膜色素變性基因，對于進(jìn)行基因診斷、理解疾病發(fā)展的分子機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)有效的治療

3、方法有著積極意義。
　　 本課題主要對兩個(gè)中國人視網(wǎng)膜色素變性家系的遺傳因素進(jìn)行研究。通過連鎖以及單倍型分析先在染色體上確定相關(guān)致病基因的位置；接著運(yùn)用DNA 直接測序法來分析該基因是否含有導(dǎo)致疾病的突變，以及突變是否在家系中共分離；再應(yīng)用高分辨率熔解曲線分析等方法，分析突變是否存在于正常人群中。
　　 我們首先對一個(gè)來自山東的常染色體隱性遺傳的家系進(jìn)行研究。通過連鎖分析和單倍型分析，我們發(fā)現(xiàn)該家系的致病基因可能與新發(fā)現(xiàn)

4、的arRP位點(diǎn)RP26 緊密連鎖，而排除了其它隱性遺傳RP基因致病的可能性。通過對RP26基因CERKL的整個(gè)編碼序列，以及外顯子與內(nèi)含子交接區(qū)的測序，發(fā)現(xiàn)病人的第一個(gè)外顯子中存在一個(gè)插入突變，即在CERKL cDNA的第156位核苷酸和157 核苷酸之間插入了一個(gè)T（c.156_157insT）；病人另一條染色體上的第5外顯子中則發(fā)現(xiàn)缺失了一個(gè)T，即CERKL cDNA的第758位核苷酸T 缺失（c.758delT）。進(jìn)一步對整個(gè)家系

5、的測序分析結(jié)果顯示先證者的母親含有c.156_157insT突變，先證者的父親則含有c.758delT突變，兩個(gè)姐妹則分別從其父母中遺傳到兩個(gè)正常的等位型，而先證者及其兩個(gè)兄弟均得到其父母兩個(gè)突變的等位型，提示CERKL 兩個(gè)復(fù)合型雜合突變c.156_157insT和c.758delT 是該家系三位患者患有視網(wǎng)膜色素變性的遺傳基礎(chǔ)。在隨后進(jìn)行的HRM結(jié)果表明，這兩個(gè)突變在100 多位正常人群中不存在。
　　 CERKL的c.15

6、6_157insT和c.758delT突變均屬于移碼突變，顯著改變了其編碼蛋白的讀碼框。C.156_157insT 由于T的插入，正好產(chǎn)生一個(gè)密碼子TGA，使得該基因的編碼產(chǎn)物提前終止，產(chǎn)生只有52個(gè)氨基酸的異常蛋白；而c.758delT突變由于第758位T的缺失，也改變了其后的閱讀框，不僅將原來的第253-258 氨基酸METDRI 序列，改變?yōu)楫惓５腞KQTES，還在第259位產(chǎn)生一個(gè)終止密碼子TGA，因而產(chǎn)生一個(gè)只有258個(gè)氨基酸

7、的異常蛋白，而不是正常CERKL基因編碼的含532個(gè)氨基酸的正常蛋白質(zhì)。
　　 目前為止，CERKL中只有三個(gè)突變被報(bào)道，并都是在同血緣關(guān)系的家系中發(fā)現(xiàn)的。而我們發(fā)現(xiàn)的這兩個(gè)新突變不僅是在中國人RP家系中的首次報(bào)道，而且是世界上第一次發(fā)現(xiàn)，CERKL的復(fù)合型雜合突變，可以在非血緣關(guān)系的家庭中，引起隱性遺傳的視網(wǎng)膜色素變性。我們的研究豐富了CERKL突變引起視網(wǎng)膜色素變性的遺傳突變譜，對于視網(wǎng)膜色素變性的基因診斷，以及認(rèn)識該基因的

8、功能，和視網(wǎng)膜色素變性發(fā)病的分子病理機(jī)制具有一定的意義。
　　 為探討這兩個(gè)CERKL突變引起視網(wǎng)膜色素變性的分子機(jī)制，我們構(gòu)建了含野生型和突變型CERKL的pEGFP-CERKL 載體，對突變的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)進(jìn)行分析。將重組載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，用共聚焦顯微鏡觀察野生型和突變型CERKL的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)突變后的CERKL 蛋白在細(xì)胞中的定位有明顯變化。
　　 本論文還對一個(gè)在來自湖北省的常染色體顯性遺傳家系進(jìn)行分子遺傳學(xué)

9、研究，通過連鎖分析我們排除了其它常染色體顯性遺傳的RP基因，發(fā)現(xiàn)該家系的致病基因與RP4 緊密連鎖；運(yùn)用DNA 直接測序法對RP4基因RHO 整個(gè)編碼區(qū)的測序，發(fā)現(xiàn)患者的RHO基因中有一個(gè)堿基替換突變，即：c.C5271T，該突變導(dǎo)致RHO 蛋白第347個(gè)氨基酸由脯氨酸變?yōu)榱涟彼幔╬.P347L）。該突變在家系中與疾病共分離，提示RHO的p.P347L 為該家系患有adRP的遺傳基礎(chǔ)。我們還對家系中兩個(gè)尚未發(fā)病的個(gè)體進(jìn)行了基因診斷。和其