RNA干擾治療視網(wǎng)膜色素變性的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 1.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因打靶技術(shù)構(gòu)建攜帶人突變RHO基因的視網(wǎng)膜變性小鼠。對(duì)構(gòu)建成功的不同鼠齡小鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行組織病理變化研究，明確其病理改變特點(diǎn)。
　　 2.制備靶向RHO基因的LV-GFP-shRNA。通過(guò)顯微注射器將慢病毒載體注射入小鼠視網(wǎng)膜下腔內(nèi)。研究注射后不同時(shí)間hRHO的mRNA和蛋白表達(dá)變化；不同時(shí)間視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)染率和視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化。從而評(píng)估RNA干擾技術(shù)治療效果，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　

2、 方法:
　　 1.構(gòu)建mRHOp-hRHO-SV40A-PBS質(zhì)粒，進(jìn)行小鼠原核受精卵注射，繁育出轉(zhuǎn)基因小鼠。RT-PCR及western-blot方法鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　 2.18只RP小鼠隨機(jī)分成4組。在小鼠出生后15天、30天、60天各處死6只。5只健康小鼠進(jìn)行對(duì)照。過(guò)量戊巴比妥鈉腹腔注射處死小鼠后迅速完整摘取小鼠眼球，沿視神經(jīng)做3mm厚度的切片。分別行HE染色、原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)和電鏡超微檢測(cè)。比較不同時(shí)間視網(wǎng)

3、膜外核層厚度的變化、感光細(xì)胞凋亡陽(yáng)性率及光感受器細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果采用組間T檢驗(yàn)，spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 3.利用前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)體外轉(zhuǎn)染基因沉默效率為79.14％的靶向hRHO的siRNA序列，構(gòu)建pGCL-GFP-shRNA慢病毒穿梭質(zhì)粒，并制備LV-GFP-shRNA。
　　 4.80只15天鼠齡RP小鼠，左眼作為對(duì)照組，不做任何處理；右眼視網(wǎng)膜下腔注射LV-GFP-shRNA。分別在注射

4、后15天、30天、45天、60天隨機(jī)各處死20只RP小鼠。應(yīng)用半定量RT-PCR及western-blot方法檢測(cè)治療后不同時(shí)間RP小鼠視網(wǎng)膜hRHO mRNA及蛋白表達(dá)變化。視網(wǎng)膜鋪片觀察治療后不同時(shí)間視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)染率，視網(wǎng)膜色素細(xì)胞熒光染色的范圍用0到3級(jí)評(píng)估。(0：沒(méi)有發(fā)現(xiàn)熒光細(xì)胞；1：散在的陽(yáng)性細(xì)胞；2：部分陽(yáng)性細(xì)胞連在一起；3：連續(xù)的陽(yáng)性細(xì)胞)。行免疫熒光染色觀察視網(wǎng)膜RHO表達(dá)，行HE染色觀察視網(wǎng)膜外核層厚度變化。
　　

5、 結(jié)果:
　　 1.mRHOp-hRHO-SV40-PBS質(zhì)粒經(jīng)各種酶切鑒定位置正確后鑒定測(cè)序。質(zhì)粒線性化位點(diǎn)為NotI和PvuI，雙酶切后可切成3037bp(回收)和1679bp、1043bp，回收3037bp用于顯微注射。小鼠受精卵注射后成功繁育出表達(dá)hRHO突變基因的RP小鼠。
　　 2.RP小鼠出生后15天，視網(wǎng)膜外核層及內(nèi)核層已經(jīng)可以分出層次。正常對(duì)照組視網(wǎng)膜外核層在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有明顯的變化(9.30±0.37

6、)，而RP小鼠出生15天外核層開(kāi)始變薄(7.05±0.25)，30天明顯變薄(5.29±0.24)，60天外核層減至單層(2.04±0.28)。TUNEL染色正常對(duì)照組為陰性，RP小鼠15天出現(xiàn)散在陽(yáng)性顆粒，60天出現(xiàn)大片陽(yáng)性顆粒。提示光感受器細(xì)胞出現(xiàn)大量壞死及凋亡。透射電鏡顯示：早期視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞外節(jié)正常、外界膜連續(xù)，30天開(kāi)始視桿細(xì)胞外節(jié)縮短，外界膜開(kāi)始變細(xì)，不連續(xù)。盤膜出現(xiàn)空泡狀改變，內(nèi)節(jié)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均有不同程度變性，溶解；細(xì)胞

7、核出現(xiàn)核濃縮，發(fā)生凋亡。
　　 3.成功構(gòu)建靶向hRHO的pGCL-GFP-shRNA慢病毒穿梭質(zhì)粒，并制備出滴度為1.0×1010ifu/ml的LV-GFP-shRNA。
　　 4.RP小鼠在進(jìn)行右眼LV-GFP-shRNA注射后30天時(shí)RHO mRNA表達(dá)開(kāi)始下降，到60天時(shí)明顯下降。組內(nèi)比較：在45天、60天mRNA表達(dá)水平LV-GFP-shRNA組較陰性對(duì)照組有明顯下降(P＜0.05)。在蛋白表達(dá)水平上，LV-G

8、FP-shRNA組在30天時(shí)較對(duì)照組表達(dá)開(kāi)始下降，45天時(shí)進(jìn)一步下降，60天時(shí)又趨于平穩(wěn)。組內(nèi)比較：在45天、60天蛋白表達(dá)水平LV-GFP-shRNA組較陰性對(duì)照組有明顯下降(P＜0.05)。視網(wǎng)膜ONL層數(shù)改變LV-GFP-shRNA組較陰性對(duì)照組在15天、30天、45天均沒(méi)有明顯差異，到60天時(shí)出現(xiàn)LV-GFP-shRNA組較陰性對(duì)照組ONL層數(shù)增厚(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功構(gòu)建

9、出表達(dá)hRHO突變基因的視網(wǎng)膜變性小鼠。為后續(xù)研究治療提供可靠的動(dòng)物模型。
　　 2.本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建出的RP小鼠模型中視網(wǎng)膜組織病理學(xué)改變與人類RHO基因突變引起的視網(wǎng)膜色素變性的病理改變類似，為下一步行基因治療療效判定提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。
　　 3.成功構(gòu)建靶向hRHO的pGCL-GFP-shRNA慢病毒穿梭質(zhì)粒，并制備出滴度為1.0×1010ifu/ml的LV-GFP-shRNA。
　　 4.LV-GFP-shRNA