RNA干擾治療視網膜色素變性的動物實驗研究.pdf

1、目的:
　　 1.本實驗通過基因打靶技術構建攜帶人突變RHO基因的視網膜變性小鼠。對構建成功的不同鼠齡小鼠視網膜進行組織病理變化研究，明確其病理改變特點。
　　 2.制備靶向RHO基因的LV-GFP-shRNA。通過顯微注射器將慢病毒載體注射入小鼠視網膜下腔內。研究注射后不同時間hRHO的mRNA和蛋白表達變化；不同時間視網膜轉染率和視網膜形態(tài)學變化。從而評估RNA干擾技術治療效果，為臨床應用提供實驗依據。
　　

2、 方法:
　　 1.構建mRHOp-hRHO-SV40A-PBS質粒，進行小鼠原核受精卵注射，繁育出轉基因小鼠。RT-PCR及western-blot方法鑒定轉基因小鼠。
　　 2.18只RP小鼠隨機分成4組。在小鼠出生后15天、30天、60天各處死6只。5只健康小鼠進行對照。過量戊巴比妥鈉腹腔注射處死小鼠后迅速完整摘取小鼠眼球，沿視神經做3mm厚度的切片。分別行HE染色、原位細胞凋亡檢測和電鏡超微檢測。比較不同時間視網

3、膜外核層厚度的變化、感光細胞凋亡陽性率及光感受器細胞超微結構的改變。結果采用組間T檢驗，spss13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。
　　 3.利用前期實驗證實體外轉染基因沉默效率為79.14％的靶向hRHO的siRNA序列，構建pGCL-GFP-shRNA慢病毒穿梭質粒，并制備LV-GFP-shRNA。
　　 4.80只15天鼠齡RP小鼠，左眼作為對照組，不做任何處理；右眼視網膜下腔注射LV-GFP-shRNA。分別在注射

4、后15天、30天、45天、60天隨機各處死20只RP小鼠。應用半定量RT-PCR及western-blot方法檢測治療后不同時間RP小鼠視網膜hRHO mRNA及蛋白表達變化。視網膜鋪片觀察治療后不同時間視網膜轉染率，視網膜色素細胞熒光染色的范圍用0到3級評估。(0：沒有發(fā)現熒光細胞；1：散在的陽性細胞；2：部分陽性細胞連在一起；3：連續(xù)的陽性細胞)。行免疫熒光染色觀察視網膜RHO表達，行HE染色觀察視網膜外核層厚度變化。
　　

5、 結果:
　　 1.mRHOp-hRHO-SV40-PBS質粒經各種酶切鑒定位置正確后鑒定測序。質粒線性化位點為NotI和PvuI，雙酶切后可切成3037bp(回收)和1679bp、1043bp，回收3037bp用于顯微注射。小鼠受精卵注射后成功繁育出表達hRHO突變基因的RP小鼠。
　　 2.RP小鼠出生后15天，視網膜外核層及內核層已經可以分出層次。正常對照組視網膜外核層在各個時間點沒有明顯的變化(9.30±0.37

6、)，而RP小鼠出生15天外核層開始變薄(7.05±0.25)，30天明顯變薄(5.29±0.24)，60天外核層減至單層(2.04±0.28)。TUNEL染色正常對照組為陰性，RP小鼠15天出現散在陽性顆粒，60天出現大片陽性顆粒。提示光感受器細胞出現大量壞死及凋亡。透射電鏡顯示：早期視網膜視桿細胞外節(jié)正常、外界膜連續(xù)，30天開始視桿細胞外節(jié)縮短，外界膜開始變細，不連續(xù)。盤膜出現空泡狀改變，內節(jié)線粒體、內質網均有不同程度變性，溶解；細胞

7、核出現核濃縮，發(fā)生凋亡。
　　 3.成功構建靶向hRHO的pGCL-GFP-shRNA慢病毒穿梭質粒，并制備出滴度為1.0×1010ifu/ml的LV-GFP-shRNA。
　　 4.RP小鼠在進行右眼LV-GFP-shRNA注射后30天時RHO mRNA表達開始下降，到60天時明顯下降。組內比較：在45天、60天mRNA表達水平LV-GFP-shRNA組較陰性對照組有明顯下降(P＜0.05)。在蛋白表達水平上，LV-G

8、FP-shRNA組在30天時較對照組表達開始下降，45天時進一步下降，60天時又趨于平穩(wěn)。組內比較：在45天、60天蛋白表達水平LV-GFP-shRNA組較陰性對照組有明顯下降(P＜0.05)。視網膜ONL層數改變LV-GFP-shRNA組較陰性對照組在15天、30天、45天均沒有明顯差異，到60天時出現LV-GFP-shRNA組較陰性對照組ONL層數增厚(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.利用轉基因技術成功構建

9、出表達hRHO突變基因的視網膜變性小鼠。為后續(xù)研究治療提供可靠的動物模型。
　　 2.本實驗構建出的RP小鼠模型中視網膜組織病理學改變與人類RHO基因突變引起的視網膜色素變性的病理改變類似，為下一步行基因治療療效判定提供形態(tài)學依據。
　　 3.成功構建靶向hRHO的pGCL-GFP-shRNA慢病毒穿梭質粒，并制備出滴度為1.0×1010ifu/ml的LV-GFP-shRNA。
　　 4.LV-GFP-shRNA