乙型肝炎病毒基因變異對(duì)T細(xì)胞免疫學(xué)應(yīng)答影響的研究.pdf

1、背景： 乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染可引起包括無(wú)癥狀攜帶、慢性乙型肝炎(chronichepatitisB，CHB)、肝硬化和肝癌的一系列肝臟疾病譜。全世界大約有3億人已經(jīng)成為HBV慢性攜帶者，我國(guó)的HBV感染者約為1.1億，約有3000萬(wàn)的乙型肝炎患者，全國(guó)每年死于與HBV感染相關(guān)肝病約30萬(wàn)人。目前尚無(wú)徹底清除HBV的理想藥物，因此HBV感染已經(jīng)成為嚴(yán)重影響我國(guó)人民健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。

2、HBV是非常容易發(fā)生變異的DNA病毒，而基因型和亞型變異是最常見(jiàn)的HBV基因變異形式，可以影響HBV基因型間差異超過(guò)全長(zhǎng)8％序列，而且基因型的分布存在明顯的地理分布特點(diǎn)和人種差異；還有YMDD變異、前C區(qū)變異、BCP變異等點(diǎn)突變可以影響HBV的生物學(xué)功能。因?yàn)樘禺愋粤馨图?xì)胞表位(epitope)是特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答得以激發(fā)的主要原動(dòng)力，處于免疫識(shí)別和免疫激活的核心位置[1]。當(dāng)變異位點(diǎn)涉及HBV表位序列時(shí)，可能會(huì)影響宿主針對(duì)HBV的免疫

3、應(yīng)答能力。因?yàn)槟壳癏BV表位主要由歐美國(guó)家學(xué)者鑒定，這些國(guó)家的HBV基因型主要以A、D為主。以HLA-A*0201限制性HBcAg18-27特異性CTL表位FLPSDFFPSV(C18-27V)為例，它被認(rèn)為是表位研究中的經(jīng)典序列，是從歐、美地區(qū)的主要流行病毒株基因型A、D中鑒定出來(lái)的；而在我國(guó)HBV基因型背景下，C18-27的結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了變化。鑒于HBV基因型和基因亞型之間的較大序列差異，鑒定適合我國(guó)病毒學(xué)背景研究的新表位，用合適的

4、HBV表位序列探究我國(guó)HBV基因(型)變異與細(xì)胞免疫應(yīng)答規(guī)律將有重要的研究意義。 目的： 調(diào)查在我國(guó)HBV優(yōu)勢(shì)基因型中，C18-27V／I變異體的分子流行病學(xué)特點(diǎn)和在細(xì)胞免疫學(xué)研究中的差異；通過(guò)B、C基因型特異性多肽池(pool)調(diào)查研究我國(guó)HBV感染者T淋巴細(xì)胞免疫特點(diǎn)，并篩選適合HBV特異性T細(xì)胞表位鑒定的調(diào)查人群；比較HBV基因型間、熱點(diǎn)變異組間T淋巴細(xì)胞免疫功能差異。 方法： 1.通過(guò)GenBan

5、k中上傳的30條HBV基因序列分析和本室測(cè)序的20條序列以DNASIS軟件對(duì)比分析，研究C18-27V／I的分布特點(diǎn)；應(yīng)用生物學(xué)軟件分析基因B、C型的C基因序列，并構(gòu)建C18-27V／I變異體的PCR-RFLP檢測(cè)方法；應(yīng)用生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)并比較C18-27V／I與HLA分子的結(jié)合力預(yù)測(cè)分值變化； 2.從我室保存的全國(guó)HBV基因型調(diào)查血清庫(kù)中，選擇160份血清，通過(guò)自行構(gòu)建的PCR-RFLP法檢測(cè)，并調(diào)查C18-27V／I變異

6、體的流行病學(xué)特點(diǎn)； 3.在我國(guó)流行分布的C18-271優(yōu)勢(shì)背景下，選取南方醫(yī)院住院的57例慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細(xì)胞，應(yīng)用四聚體染色技術(shù)、體外增殖培養(yǎng)技術(shù)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)，比較外周血中C18-27I特異性淋巴細(xì)胞的頻數(shù)與C18-27V特異性淋巴細(xì)胞頻數(shù)的差別，以及分析兩者間T淋巴細(xì)胞功能上的差異； 4.檢測(cè)57例慢性乙型肝炎患者臨床常規(guī)指標(biāo)(ALT、TBil、HBVDNA)以及HBV基因型，比較分析C18-27V／

7、I特異性淋巴細(xì)胞頻數(shù)與這些臨床指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系； 5.依據(jù)我國(guó)HBV基因型B、C中的特點(diǎn)，參考20條GenBank序列，設(shè)計(jì)針對(duì)我國(guó)HBV基因型B、C重疊多肽；并且設(shè)計(jì)混合多肽pool，以便在我國(guó)HBV基因背景下檢測(cè)淋巴細(xì)胞的特異性應(yīng)答反應(yīng)； 6.選取南方醫(yī)院感染內(nèi)科住院的38例HBV感染者的外周血淋巴細(xì)胞，以及10例健康對(duì)照者的外周血淋巴細(xì)胞，依據(jù)HBV感染的臨床特點(diǎn)將患者分成HBeAg陰性慢性乙型肝炎組、HBeAg陽(yáng)性

8、慢性乙型肝炎組、HBV感染肝衰竭組、肝硬化組等，通過(guò)多肽誘導(dǎo)IFN-γ分泌，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，比較不同臨床組間特異性T淋巴細(xì)胞分泌功能的差異； 7.分析38例樣本的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，比較本研究設(shè)計(jì)的不同基因型多肽pool間在誘導(dǎo)HBV特異性淋巴細(xì)胞分泌的差異； 8.檢測(cè)38例HBV感染者HBV基因型，分析B、C基因型患者間特異性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)差異； 9.檢測(cè)38例HBV感染者前C區(qū)變異、BCP變

9、異，分析變異陽(yáng)性與陰性組間特異性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)差異； 10.收集38例HBV感染者臨床資料，分析臨床常規(guī)指標(biāo)(ALT、TBil、HBVDNA)與HBV特異性淋巴細(xì)胞功能的關(guān)系； 結(jié)果： 1.通過(guò)比對(duì)GenBank序列發(fā)現(xiàn)C18-27I在各國(guó)基因B、C型的流行株中有廣泛的分布，而C18-27V則在其它基因型流行株廣泛分布； 2.我們成功構(gòu)建了一種PCR.RFLP的方法，可以在基因B、C流行區(qū)簡(jiǎn)便快捷的篩

10、選C18-27V/I變異體； 3.通過(guò)來(lái)自全國(guó)8省市的160份血清調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在我國(guó)主要流行的B、C基因型中，C18-271毒株成為主要病毒學(xué)背景，陽(yáng)性率98.12％(157／160)； 4.C18-27V/I四聚體染色慢性乙型肝炎外周血淋巴細(xì)胞結(jié)果提示：在C18-271病毒學(xué)背景下HLA-A2患者外周血C18-27I特異性淋巴細(xì)胞較C18-27V特異性淋巴細(xì)胞頻數(shù)高(0.335±0.479％vs0.221±0.392％)

11、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012); 5.經(jīng)過(guò)C18-27V／I肽誘導(dǎo)后C18-27V／I四聚體及CD8雙陽(yáng)性細(xì)胞比誘導(dǎo)前明顯增殖(2-10倍)，其中C18-27I誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖能力高于C18-27V肽，并發(fā)現(xiàn)兩肽之間在誘導(dǎo)增殖方面存在明顯的交叉反應(yīng)； 6.C18-27V/I肽分別誘導(dǎo)12例HLA-A2陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細(xì)胞并直接酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè)IFN-γ分泌，兩肽均未誘導(dǎo)出陽(yáng)性斑點(diǎn)； 7.通

12、過(guò)序列比對(duì)，我們?cè)O(shè)計(jì)了HBV基因B、C型覆蓋HBV全長(zhǎng)的282條重疊多肽，每肽18個(gè)氨基酸，相鄰多肽重疊10個(gè)氨基酸；并設(shè)計(jì)了10個(gè)多肽pool，每pool包含22-34條肽，分別區(qū)分兩種HBVB／C基因型，區(qū)分HBVX、C、S和P基因區(qū)； 8.將38例HBV感染者和10例健康獻(xiàn)血員分成HBeAg陰性慢性乙型肝炎組(G1=12)、HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎組(G2=11)、急性肝衰竭組(G3=5)、肝硬化(G4=8)、急性HBV

13、感染組(G5=2)、特殊HBV標(biāo)志物組(G6=4)和健康對(duì)照組(G7=6)；G7組的斑點(diǎn)均數(shù)為(2.208±3.924SFC)，確定陽(yáng)性pool的Cutoff=10SFC； 9.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)比較各組間(G1-G7)斑點(diǎn)分布結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=15.277，P=0.018)；在慢性HBV感染組(G1-G4)中進(jìn)行比較，組間各樣本總斑點(diǎn)數(shù)之間差異不顯著(X2=6.5，P=0.088)，但陽(yáng)性pool的數(shù)量差異顯著，有統(tǒng)計(jì)

14、學(xué)意義(X2=9.2，P=0.027)；進(jìn)一步比較G1、G2組間樣本的陽(yáng)性pool數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(z=-2.345，P=0.019)，陽(yáng)性pool病例數(shù)之間的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(X2=5.856，P=0.016); 10.HBV感染各組(G1-G5)中，有HBVDNA檢測(cè)結(jié)果的36例資料，分析ALT水平與淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ總斑點(diǎn)均數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系，經(jīng)非參數(shù)相關(guān)檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(CC=0.352，P=0.030)；log

15、DNA與淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ總斑點(diǎn)數(shù)有負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，但經(jīng)非參數(shù)相關(guān)分析無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(CC=-0.114，P=0.495)； 11.檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HBV基因B型(23例)比基因C型(9例)患者有較高的特異性淋巴細(xì)胞總斑點(diǎn)數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(z=-2.517，P=0.012)；分別比較兩型問(wèn)代表S基因區(qū)pool總斑點(diǎn)數(shù)的(Sgene)和代表P基因區(qū)pool總斑點(diǎn)數(shù)的(Pgene)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(z=-2.194，P=0.028；z=-

16、2.479，P=0.013)；而兩型間代表X基因區(qū)和C基因區(qū)的斑點(diǎn)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(z=-1.635，P=0.102；z=-0.728，P=0.467)； 12.發(fā)現(xiàn)前C變異和BCP變異陽(yáng)性組在樣本總斑點(diǎn)數(shù)和代表C基因區(qū)的斑點(diǎn)數(shù)較對(duì)應(yīng)的陰性組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C基因區(qū)的斑點(diǎn)數(shù)在變異組中有升高趨勢(shì)； 結(jié)論： 1.C18-27I毒株是我國(guó)HBV感染者的主要病毒學(xué)背景；在此背景下，外周血C18-27I的特異性淋巴細(xì)胞