乙型肝炎病毒HLA-A2限制性env-183-191表位變異對細胞毒性T淋巴細胞的識別和免疫應答的影響.pdf

1、背景: HBV感染是我國重大的公共衛(wèi)生問題。HBV感染就臨床表現(xiàn)而言形式多樣,可出現(xiàn)急性肝炎、慢性肝炎、肝臟纖維化、肝硬化及肝細胞癌等。部分感染患者可在慢性肝炎基礎上出現(xiàn)急性發(fā)作,導致肝功能衰竭,即慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF),死亡率高。作為機體清除或控制肝細胞內HBV感染的重要免疫細胞——HBV抗原表位特異性CTL,它可識別HBV蛋白中的CTL表位(epitope),進而發(fā)

2、揮其免疫作用。本研究在對不同基因型的急性乙型肝炎(acute hepatitis B,AHB)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)和ACLF患者的HBV HLA-A2限制性特異性CTL表位變異分析的基礎上,針對與疾病進展相關有統(tǒng)計學意義的變異表位進行體外HLA-A2分子親和力鑒定并對 HBV包膜蛋白(envelop protein)上的HLA-A2限制性表位env183-191野生/變異多肽在HLA-A2轉基

3、因C57小鼠體內誘導出的 CTL細胞對野生表位的識別和體外殺傷能力進行研究,為進一步分析研究HBV感染患者重癥化機制奠定了基礎。
　　目的:1.在獲得的不同診斷的乙型肝炎患者來源的HBV全長序列,對比分析其已鑒定的HBV HLA-A2限制性表位的變異形式和變異后親和力的變化,確定與疾病進程相關的表位變異類型。2.由于HLA-A2限制性表位env:183-191表位變異率在AHB和ACLF中較高,而CHB中較低,推測可能與宿主炎癥反

4、應有關,因此選擇其作為研究對象,明確其野生表位和變異表位在HLA-A2轉基因C57小鼠中的特異性CTL免疫識別和殺傷效應。
　　方法:1.“兩片段”法PCR擴增獲得不同診斷的乙型肝炎患者血清HBV全長序列516條,對來源于HLA-A2陽性患者的C基因型HBV全長序列分析發(fā)現(xiàn)有12個表位的變異與乙肝疾病進程相關,有統(tǒng)計學意義。對已發(fā)現(xiàn)的12個存在變異的表位在BIMAS網站進行親和力預測,隨后采用人抗原呈遞相關轉運蛋白缺陷型淋巴細胞系

5、(T2)對env:183-191野生/變異表位進行體外親和力實驗。2.挑選HLA-A2限制性表位env:183-191(野生型WT:FLLTRILTI)和其對應變異表位(S: FSLTRILTI;K:FLLTKILTI; SK:FSLTKILTI)構建HBV env蛋白pcDNA-3.1(+)真核表達載體,免疫HLA-A2轉基因C57小鼠同時用相應的表位多肽加強免疫5周后取小鼠脾淋巴細胞進行ELISOPT、HLA-A2/五聚體(Pent

6、amer)和體外細胞殺傷實驗。
　　結果:1.BIMAS親和力預測顯示有10個表位變異后與HLA-A2分子的親和力減弱,2個表位變異后親和力增強。T2細胞結合試驗檢測env:183-191野生型和變異型表位親和力結果與BIMAS預測結果一致。2.env:183-191野生/變異表位免疫小鼠后,ELISOPT實驗顯示,WT有較強的IFN-γ分泌能力,K,S和SK能力較弱。Pentamer細胞染色流式分析后顯示K變異表位疫苗免疫小鼠對

7、野生表位CTL有交叉反應,但對S變異表位無交叉反應;S變異表位疫苗免疫小鼠對野生表位CTL有交叉反應,但對K變異表位無交叉反應。SK變異表位疫苗免疫小鼠對野生表位和S變異表位有交叉反應,但對K變異表位無交叉反應;野生表位疫苗免疫小鼠可誘導產生較弱的針對K與S變異表位的交叉反應。殺傷實驗結果與ELISPOT結果一致。WT免疫小鼠中特異性CTL的殺傷結果要明顯高于其他變異型表位多肽免疫小鼠中的。結果顯示變異型表位可誘導較野生型表位弱的CTL