重組人組織因子腺病毒干擾載體的構建及其轉染人血管平滑肌的體外研究.pdf

1、背景/意義：
　　 動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)生發(fā)展是一種多因素綜合作用導致的慢性血管性疾病，單獨的一種學說不能完全解釋AS的病因及發(fā)病過程。炎癥反應和凝血系統(tǒng)的激活在動脈粥樣硬化發(fā)病過程中起著重要作用，炎癥可導致凝血系統(tǒng)的激活，而凝血活動又可影響炎癥的反應。組織因子(tissue factor，TF)作為一種天然的凝血系統(tǒng)啟動子，在動脈粥樣硬化的炎癥反應和凝血級聯(lián)反應中均扮演著重要角色。將TF作為

2、靶點，有可能成為治療AS引起的各種急性心血管性疾病的一個可靠靶點。本研究試圖利用RNA干擾原理，以腺病毒為載體，將針對TF基因的外源性發(fā)夾環(huán)小干擾RNA片斷導入腺病毒載體，通過體外重組技術構建穩(wěn)定表達TF-shRNA的重組體腺病毒，并觀察這種重組腺病毒感染白介素-18(interleukin-18，IL-18)刺激下，血管平滑肌細胞中TF產生的變化，以探討RNA技術在治療血栓性疾病的的應用前景，并為研究TF的多種生物學效應建立實驗基礎，

3、為將TF作為基因治療靶點提供實驗依據(jù)，為治療動脈粥樣硬化引發(fā)的各種疾病開辟新途徑。本實驗主要分成以下3部分。
　　 方法和內容：
　　 第一部分人組織因子干擾載體的構建和真核表達
　　 目的：1、篩選較高轉染效率的轉染試劑，并進一步優(yōu)化該轉染試劑在轉染人TF小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)時的轉染條件。2、構建攜帶TF基因的發(fā)夾環(huán)小干擾RNA(short hairpin R

4、NA，shRNA)的質粒表達載體，觀察重組質粒對TF基因的沉默效果。
　　 方法：1、分別利用含GFP綠色熒光蛋白的報告質粒pEGFP-N1和Lipofectamine TM2000與Lipofectamine TM-PLUS進行轉染，熒光顯微鏡下觀察各組細胞的轉染效率；參照文獻和RNA干擾靶序列設計原則，化學合成含有熒光的siRNA，并利用篩選具有較高轉染效率的轉染試劑，優(yōu)化其轉染人TF的siRNA時的轉染條件。2、設計合成針

5、對TF基因的小發(fā)夾環(huán)結構的RNA(shRNA)，克隆至含CMV啟動子的穿梭質粒表達載體pShuttle-CMV-1.0，構建重組質粒，采用脂質體-Lipofectamine TM2000轉染HEK-293細胞株，反轉錄半定量聚合酶鏈反應法(reverse transcriptase polymerasechain reaction，RT-PCR)檢測攜帶TF-shRNA質粒表達載體抑制TF mRNA表達的效果。3、所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差

6、(Means±S.D.)表示，多個樣本均數(shù)比較采用析因設計的方差分析，多重比較采用Bonferroni法。
　　 結果：1、Lipofectamin TM2000具有較高的轉染效率，經過優(yōu)化其轉染siRNA的效率大于90％。2、成功構建了攜帶TF-shRNA的質粒表達載體pShuttle-CMV-TF-shRNA，酶切鑒定及測序證實插入的外源基因序列正確。3、RT-PCR方法檢測重組質粒轉染后，HEK-293細胞中TF mRNA

7、的表達變化。轉染對照組TF mRNA值為3.66±0.01，在轉染含有TF shRNA重組質粒組后24h、48h和72h，TF mRNA表達水平為2.11±0.01、1.21±0.05和0.56±0.01，與對照組相比，TF mRNA水平顯著降低，結果有統(tǒng)計學意義(F=59076.697，P=0.000)，提示了TF shRNA重組質粒組能明顯降低TF基因表達水平。
　　 結論：1、經過優(yōu)化轉染條件，陽離子脂質體Lipofect

8、amineTM2000可以將化學合成的siRNA高效地轉染293細胞。2、成功構建攜帶TF-shRNA的質粒表達載體，構建的重組質?？擅黠@下調TF基因mRNA的表達水平，RNA干擾效果明顯。
　　 第二部分攜帶人組織因子的重組腺病毒載體的制備和構建
　　 目的：構建攜帶TF-shRNA的重組腺病毒表達載體。
　　 方法：連接線性化腺病毒骨架質粒(LacZ)和帶有CMV啟動子的穿梭載體質粒pShuttle-TF-s

9、hRNA，采用磷酸鈣共沉淀法將兩種質粒表達載體共轉化HEK-293包裝細胞，兩種質粒在HEK-293細胞內進行同源重組以獲得重組體腺病毒，氯化銫密度梯度離心法純化并檢測病毒滴度，用構建的重組腺病毒感染Hela細胞，檢測重組腺病毒的生物安全性。3、所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(Means±S.D.)表示，多個樣本均數(shù)比較采用析因設計的方差分析，多重比較采用Bonferroni法。
　　 結果：采用同源重組法構建復制缺陷型重組腺病毒載體，

10、酶切鑒定后進行大量擴增，氯化銫密度梯度離心法純化，檢測病毒滴度為3×1010pfu/ml。MOI值100的病毒液感染HeLa細胞后，各組細胞生長狀態(tài)無顯著性差異(P=0.329)。
　　 結論：成功構建了攜帶TF-shRNA的腺病毒表達載體Ad-TF-shRNA，載體穩(wěn)定，易于純化和擴增，病毒滴度高，并具有較高的生物安全性。
　　 第三部分人重組組織因子腺病毒的體外功能初步研究
　　 目的：在成功構建腺病毒表達載

11、體Ad-TF-shRNA的基礎上，進行體外實驗研究，探討在白介素-18(interleukin-IL-18，IL-18)作用下，腺病毒載體對人臍動脈血管平滑肌TF抗原、凝血活性、mRNA和蛋白表達的變化。
　　 方法：1、采用組織塊培養(yǎng)法分離人臍動脈血管平滑肌細胞，α-actin免疫組織化學檢查陽性鑒定為平滑肌細胞。采用第3-4代細胞用于本實驗研究。2、采用直接感染法，用重組腺病毒感染血管平滑肌細胞(SMCs)，確定最佳MOI，

12、采用MTT法檢測重組腺病毒對血管平滑肌細胞生長狀態(tài)的影響；一期凝血法、ELISA法檢測在IL-18作用下，分別于感染后8、24、48和72h檢測細胞TF抗原、凝血活性的變化，并應用RT-PCR及Western b1ot方法檢測感染后血管平滑肌細胞內TF基因mRNA及蛋白表達水平的改變。3、所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(Means±S.D.)表示，多個樣本均數(shù)比較采用析因設計的方差分析，多重比較采用Bonferroni法。
　　 結果：

13、1、相差顯微鏡檢查傳代后的血管平滑肌細胞呈“峰”、“谷”狀生長；α-actin免疫組織化學檢查符合平滑肌細胞特征，第3-4代用于本實驗研究。2、當MOI為50時，平滑肌細胞的感染效率為80％以上，當MOI為100時，平滑肌細胞的感染效率幾乎為90％，說明重組腺病毒體外轉染效率高，且細胞生長狀態(tài)良好。3、臺盼蘭法分別在感染后1、3、4和8d細胞計數(shù)，結果顯示，與對照組相比，在Ad-TF-shRNA和Ad-GAPDH-shRNA感染細胞天數(shù)

14、相同時，細胞計數(shù)無顯著性差異；各組感染后細胞生長狀態(tài)良好，隨著感染天數(shù)的增多，細胞數(shù)增多，有顯著性差異(P＜0.05)，采用時間點細胞數(shù)與對照組相比，無顯著性變化(P＞0.05)。4、在100ng/mL的IL-18作用下，與對照組相比，平滑肌細胞8h、24h、48h和72h后上清液中TF抗原含量和凝血活性都有顯著性升高(P=0.000)，含有TF特異片段的重組腺病毒Ad-TF-shRNA感染SMCs8h后，與IL-18作用處理組相比，T

15、F抗原含量和凝血活性均明顯降低(P=0.000)。RT-PCR結果顯示，在感染后24、48和72內，與對照組相比相比，Ad-TF-shNA能顯著降低細胞內TF表達水平(P=0.000)；Western-blot結果亦證實，我們構建的靶向TF的Ad-TF-shRNA感染平滑肌細胞后，細胞內TF蛋白明顯下降，與RT-PCR結果一致。以上結果提示IL-18可誘導血管平滑肌產生大量的TF，并具有較高的凝血活性，構建的攜帶TF shRNA的重組腺

16、病毒Ad-TF可降低血管平滑肌細胞中TF含量和凝血活性，并且這種抑制作用是在mRNA和蛋白水平的抑制。
　　 結論：1、重組腺病毒Ad-TF對體外培養(yǎng)的人臍動脈血管平滑肌生長狀態(tài)無影響。2、IL-18可誘導血管平滑肌細胞產生并表達TF，這種誘導作用可以由腺病毒載體介導的RNA干擾TF基因表達后，明顯抑制TF含量和凝血活性，且這種作用是在mRNA及蛋白水平的抑制。
　　 創(chuàng)新點：
　　 1、本研究首次運用發(fā)夾環(huán)小干