小鼠角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子及其受體的重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、背景：角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)是一種備受關(guān)注的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，其對(duì)肺泡上皮細(xì)胞(AECs)的多途徑、多水平的保護(hù)作用已經(jīng)廣為認(rèn)可，既往研究表明KGF對(duì)急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)，以及肺纖維化(PF)均有預(yù)防作用，能夠明顯緩解病情改善預(yù)后。但是，就其應(yīng)用而言，主要存在如下問(wèn)題：(1)KGF蛋白昂貴；(2)KGF目前僅限于預(yù)防。因此，構(gòu)建KGF、角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(KGFR)的重組腺病毒載體對(duì)于探索肺部疾病的治

2、療；探討KGF，及其他細(xì)胞生長(zhǎng)因子在肺損傷免疫進(jìn)程中的作用都將是一個(gè)有力的工具。 目的：構(gòu)建表達(dá)小鼠KGF、KGFR基因的重組腺病毒。 方法：(1)根據(jù)小鼠KGF、KGFR基因序列，設(shè)計(jì)正向、反向引物；同時(shí)，提取小鼠肺組織RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)反應(yīng)，構(gòu)建cDNA文庫(kù)。構(gòu)建聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCPO反應(yīng)體系，擴(kuò)增目的基因片段。(2)選擇pShuttle-CMV(卡那霉素抗性)作為載體質(zhì)粒，根據(jù)引物設(shè)計(jì)

3、所選擇的核酸內(nèi)切酶，對(duì)載體質(zhì)粒和目的基因片段進(jìn)行雙酶切。將線性化的兩條DNA連接后，進(jìn)行擴(kuò)增，提取穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-KGF(pKGF)、pShuttle-CMVoKGF(pKGFR)。(3)核酸內(nèi)切酶Pme Ⅰ線性化pKGF、pKGFR，通過(guò)轉(zhuǎn)化含病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1(氨芐西林抗性)的大腸桿菌 BJ5183 以連接病毒骨架DNA，提取病毒質(zhì)粒pAdeasy-1-pShuttle-CMV-KGF(pAd-KGF)

4、，pAdeasy-1-pShuttle-CMV-KGFR(pAd-KGFR)，Pac Ⅰ酶切鑒定后，大量擴(kuò)增質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。提取重組腺病毒Adeasy-1-pShuttle-CMV-KGF(Ad-KGF)，Adeasy-1-pShuttle-CMV-KGFR(Ad-KGFR)，大量擴(kuò)增，氯化銫梯度離心純化，測(cè)量病毒滴度。 結(jié)果：(1)DNA測(cè)序結(jié)果表明pKGF所載基因僅于第48bp處G突變?yōu)锳，考慮氨基酸翻譯簡(jiǎn)并性，

5、不影響KGF表達(dá)；pKGFR則完全符合，提示成功構(gòu)建穿梭質(zhì)粒。(2)線性化穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BJ5183細(xì)菌后，細(xì)菌生長(zhǎng)于含Kan的LB平板，同時(shí)Pac Ⅰ酶切顯示目的條帶，提示成功構(gòu)建含KGF、KGFR基因的病毒質(zhì)粒。(3)顯微鏡下觀察HEK293細(xì)胞出現(xiàn)病理形態(tài)變化，表明病毒合成并進(jìn)行復(fù)制。(4)測(cè)得Ad-KGF、Ad-KGFR病毒滴度，分別為3.0×10<'11>PFU/ml、2.25×10<'11>PFU/ml。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)