聯(lián)合種植肌成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建組織工程心臟瓣膜的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的： 心臟瓣膜病是我國(guó)的常見(jiàn)病之一，嚴(yán)重危害著國(guó)人健康，瓣膜置換術(shù)是外科治療嚴(yán)重心臟瓣膜疾病的主要方法。目前臨床上應(yīng)用的人工心臟瓣膜主要有機(jī)械瓣和生物瓣兩種。機(jī)械瓣置換后須終生服用抗凝藥，因抗凝不當(dāng)而造成的出血、血栓形成及栓塞是影響患者長(zhǎng)期存活及生活質(zhì)量的重要因素：生物瓣置換后，盡管無(wú)需長(zhǎng)期抗凝治療，但由于瓣膜缺乏生命活力，術(shù)后易發(fā)生生物瓣退行性變、鈣化而導(dǎo)致瓣膜衰敗，部分患者需二次手術(shù)置換。此外，這些人工心臟瓣膜均不具

2、有生長(zhǎng)能力，尤其不適用于兒童或年輕心臟瓣膜病患者。 隨著組織工程學(xué)科的發(fā)展，組織工程心臟瓣膜(Tissue Engineering HeartValve,TEHV)被認(rèn)為是根本解決心臟瓣膜置換術(shù)后并發(fā)癥的革命性產(chǎn)品，自提出以來(lái)一直被人們寄予厚望。TEHV是按照組織工程學(xué)方法，將體外培養(yǎng)、擴(kuò)增的自體活細(xì)胞種植在可降解材料構(gòu)建的瓣膜支架上，使自體活細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)并產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，逐漸形成具有活性的瓣膜組織，培養(yǎng)出一種無(wú)免疫源性、無(wú)

3、需抗凝、耐久性強(qiáng)的新一代生物心臟瓣膜。同時(shí)，由于它具有生物活性，可在體內(nèi)生長(zhǎng)、發(fā)育，并可抵御感染入侵，尤其適用于兒童或感染性心內(nèi)膜炎患者。 自1995年Shinoka首先在體外培養(yǎng)TEHV并于羊體內(nèi)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以來(lái)，國(guó)內(nèi)外已進(jìn)行了大量的研究，并已在種子細(xì)胞的選擇、瓣膜支架材料的獲取等方面取得一定的進(jìn)展。但是在細(xì)胞種植的方法、條件、培養(yǎng)環(huán)境等方面尚未找到理想的辦法，如何將種子細(xì)胞簡(jiǎn)便、牢固地種植于瓣膜支架材料上已成為目前噬待解決的

4、關(guān)鍵問(wèn)題之一。本實(shí)驗(yàn)就是在總結(jié)了前人細(xì)胞種植時(shí)單獨(dú)種植一種細(xì)胞細(xì)胞容易脫落的失敗經(jīng)驗(yàn)上，并依據(jù)正常人體心臟瓣膜結(jié)構(gòu)是由兩層不同細(xì)胞構(gòu)成的客觀事實(shí)，提出了聯(lián)合種植肌成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建TEHV的設(shè)想。嘗試在瓣膜支架材料上分層依次聯(lián)合種植肌成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)光鏡、電鏡及免疫組織化學(xué)染色等方法觀察其生長(zhǎng)特點(diǎn)，探索構(gòu)建結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、功能完善的TEHV的最佳細(xì)胞種植方法。 材料與方法： 1、無(wú)菌條件下抽取人骨髓5ml，利用

5、密度梯度離心法分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，將細(xì)胞分成兩組：一組在DMEM-LG培養(yǎng)液中培養(yǎng)、擴(kuò)增；另一組在含有血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的M199培養(yǎng)液中誘導(dǎo)培養(yǎng)、擴(kuò)增，使其定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)。并進(jìn)行BMSCs和ECs的相關(guān)鑒定。 2、瓣膜支架材料采用豬主動(dòng)脈瓣膜，經(jīng)低濃度胰蛋白酶+EDTA+DCA+核酸酶的組合方法脫細(xì)胞后縫制在人工瓣環(huán)上建成完整瓣膜支架。并應(yīng)用掃描電鏡觀察脫細(xì)胞效果。 3、細(xì)

6、胞種植分3組同時(shí)培養(yǎng)做對(duì)比研究：聯(lián)合種植肌成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，共培養(yǎng)4周，單獨(dú)種植其中一種細(xì)胞作為對(duì)照組，各培養(yǎng)2周。取樣分別行HE染色、免疫組化染色、掃描電鏡觀察等對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組瓣膜進(jìn)行結(jié)構(gòu)及功能鑒定。 結(jié)果： 1、研究證實(shí)，BMSCs的自然分化方向?yàn)榧〕衫w維細(xì)胞，而在加入VEGF等誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)液中培養(yǎng)可以定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞。 2、豬主動(dòng)脈瓣膜結(jié)構(gòu)與人體瓣膜相似，經(jīng)胰蛋白酶、脫氧膽酸和核酸酶處理

7、后，可發(fā)現(xiàn)瓣膜表面細(xì)胞去除完全，纖維支架結(jié)構(gòu)保存完整。 3、實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比較，瓣膜支架表面有復(fù)層細(xì)胞生長(zhǎng)，最外面有單層內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞間連接緊密，在流體環(huán)境中培養(yǎng)，細(xì)胞表現(xiàn)出一定的方向性。 結(jié)論： 聯(lián)合種植肌成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建的TEHV，細(xì)胞數(shù)量多，排列緊密，黏附牢固，無(wú)論在結(jié)構(gòu)還是功能上都更接近于人體的瓣膜，更符合臨床的應(yīng)用要求。與單獨(dú)種植一種細(xì)胞相比較，分層依次聯(lián)合種植兩種細(xì)胞是一種先進(jìn)的、有效的