新生兒黃疸的預(yù)測(cè)、干預(yù)治療措施研究.pdf

1、目的： 嚴(yán)重高膽紅素血癥可以導(dǎo)致膽紅素腦損傷甚至核黃疸。為了減少嚴(yán)重高膽紅素血癥及膽紅素腦損傷甚至核黃疸的發(fā)生，本課題從臨床、實(shí)驗(yàn)方面進(jìn)行了研究，分為三個(gè)階段進(jìn)行。①尋找一種簡(jiǎn)單易行的臨床指標(biāo)，預(yù)測(cè)新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生。故通過(guò)測(cè)定早產(chǎn)兒及足月兒臍血甲胎蛋白值，探討臍血甲胎蛋白水平與新生兒黃疸發(fā)生是否存在相關(guān)性。同時(shí)需要了解生后血清甲胎蛋白與膽紅素水平的相關(guān)性。②UGT1A1的活性與血清膽紅素水平密切相關(guān)，因此研究大鼠肝臟發(fā)育

2、不成熟期其葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1活性的發(fā)育規(guī)律，為如何預(yù)防及基因治療新生兒高膽紅素血癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。③基因治療新生兒高膽紅素血癥能較長(zhǎng)時(shí)間維持低血清膽紅素水平，因此是非常有前景的治療方案。首先獲得表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸酶(UGT1A1)基因；構(gòu)建UGT1A1重組腺相關(guān)病毒載體，為應(yīng)用UGT1A1重組腺相關(guān)病毒載體糾正UGT1A1基因缺陷所致UGT1A1減少或缺失而發(fā)生的高膽紅素血癥做前期準(zhǔn)備。 方法： 1、檢測(cè)早產(chǎn)兒及

3、足月兒臍血AFP和血清膽紅素。 (1)取38例早產(chǎn)兒(其中胎齡在32周～33周8例，34周～35周13例，36周～＜37周的17例)臍血標(biāo)本各2ml測(cè)定AFP值，所有早產(chǎn)兒在生后3天(57±10h)測(cè)定血清總膽紅素水平。 (2)取120例足月兒臍血測(cè)定AFP值，并測(cè)定生后3天的總膽紅素值，再隨機(jī)抽取其中發(fā)生高膽紅素血癥的患兒25例為實(shí)驗(yàn)組，以未發(fā)生高膽紅素血癥的新生兒30例作為對(duì)照組測(cè)定生后1月內(nèi)血清AFP值。

4、繪制散點(diǎn)圖，求直線回歸方程。 2、用Matern方法放射測(cè)定不同孕齡(孕17天～19天各5只)及出生后不同日齡(生后1～5天各10只，生后2周的5只)大鼠的肝臟葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1活性，并制作放射自顯影圖。 3、設(shè)計(jì)、合成引物，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)從HepG2細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增UGT1A1基因，構(gòu)建UGT1A1基因克隆載體，陽(yáng)性重組子篩選和測(cè)序。UGT1A1最終連接于pAAV-MCS，雙酶切、PCR鑒

5、定陽(yáng)性重組質(zhì)粒。pAAV-UGT1A1、pAAV-RC、pHelper同時(shí)轉(zhuǎn)移入HEK293T細(xì)胞，光鏡下觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的形態(tài)變化，熒光顯微鏡下記數(shù)發(fā)綠色熒光的細(xì)胞，間接了解轉(zhuǎn)染的效率，并測(cè)定重組腺相關(guān)病毒的滴度。 結(jié)果： 1、早產(chǎn)兒組臍血AFP值與生后3天的總膽紅素值呈線性相關(guān)。足月兒組臍血AFP值與生后3天的總膽紅素值呈線性相關(guān)。生后1月內(nèi)血清AFP值實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著性差異(P＜0.01)。 2、大鼠肝

6、臟在孕17天～19天UGT1A1活性較低，而且增長(zhǎng)幅度小，孕19天UGT1A1活性占成熟鼠活性的6.7％。生后1～2天時(shí)增長(zhǎng)幅度很大，生后5天基本達(dá)成熟鼠水平，占成熟鼠活性的88.1％。將孕17天、孕19天、生后1天、成熟鼠這4組UGT1A1活性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從放射自顯影圖可以更加明確此規(guī)律。 3、成功擴(kuò)增了人類(lèi)UGT1A1基因，篩選出UGT1A1基因陽(yáng)性克隆載體。UGT1A1連接于pAAV-MCS，構(gòu)建表

7、達(dá)UGT1A1基因重組腺相關(guān)病毒載體，并成功表達(dá)于HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染了UGT1A1基因重組腺相關(guān)病毒載體的細(xì)胞光鏡下出現(xiàn)皺縮、脫落，熒光顯微鏡下可見(jiàn)多個(gè)細(xì)胞顯示很強(qiáng)的綠色熒光，提示轉(zhuǎn)染效率較高，可達(dá)70％以上。經(jīng)計(jì)算病毒滴度為105.6PFU/ml。 結(jié)論： 1、新生兒甲胎蛋白值可作為肝臟發(fā)育成熟度的標(biāo)志，為臨床預(yù)測(cè)高膽紅素血癥發(fā)生提供了另一指標(biāo)。臍血甲胎蛋白值的范圍對(duì)預(yù)測(cè)膽紅素水平也有關(guān)。此項(xiàng)測(cè)定可以對(duì)嚴(yán)重的高膽

8、紅素血癥進(jìn)行預(yù)測(cè)，以便及早進(jìn)行干預(yù)治療，該項(xiàng)檢測(cè)容易在臨床中推廣使用。 2、不成熟大鼠肝臟葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1活性很低，生后活性迅速增加達(dá)到成熟水平。研究結(jié)果提供了圍產(chǎn)期和成熟期UGT1A1活性的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?？梢赃x擇有效的時(shí)間段，對(duì)因肝臟葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1活性不足導(dǎo)致的新生兒高膽紅素血癥進(jìn)行基因治療。 3、本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了人類(lèi)UGT1A1重組腺相關(guān)病毒載體，為因UGT1A1活性不足導(dǎo)致的高膽紅素血癥的基因治療奠定基礎(chǔ)