1909.胞外hmgb1調(diào)控p53表達(dá)在t淋巴細(xì)胞中的作用及機(jī)制

1、llvlllLl[／3llllll2lllll6llLIllIlllLOUllll7llLH2IIII單位代碼10602學(xué)號(hào)20140llll8分類號(hào)R34密級(jí)公開國＼o：：／屋彩印徑尤路稚尤背aUANGXlNORMALU～I(xiàn)VE宙SiTV碩士學(xué)位論文胞外HMGBl調(diào)控p53表達(dá)在T淋巴細(xì)胞中的作用及機(jī)制TheRoleandMechanismofExtracellularHMGBlRegulatedp53ExpressioninTLym

2、phocytes學(xué)院：專業(yè)：研究方向：年級(jí)：研究生：指導(dǎo)教師：完成日期；生命科學(xué)學(xué)院生物學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)2014級(jí)賈敏童亞林20174fUlllIFIIrr／llllllfl／llIlrf1111IlllfY3261072胞外HMGBl誘導(dǎo)p53表達(dá)在T淋巴細(xì)胞中的作用及機(jī)制研究生：賈敏年級(jí)：2014級(jí)導(dǎo)師：童亞林學(xué)科專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究方向：重大疾病分子機(jī)理摘要目的1)明確高遷移率蛋白族BI(hi【曲mobilityg

3、roupbox一1protein，HMGBl)對T淋巴細(xì)胞增殖的影響。2)探究HMGBl對p53(tumorprotein53，p53)表達(dá)的影響。3)通過于擾p53表達(dá)，明確p53在介導(dǎo)HMGBl對T淋巴細(xì)胞增殖抑制的作用，并進(jìn)一步探討p53在tlMGBI誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞凋亡和功能紊亂中的作用。4)檢測絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPKs)通路活性以探索HMGBl誘導(dǎo)p53表達(dá)的可

4、能機(jī)制。5)利用特異性p38抑制劑，明確p38信號(hào)通路在HMGBl誘導(dǎo)p53活化中的作用。方法1)根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間將Jurkat細(xì)胞分為0(正常組)、12、24、48h培養(yǎng)組，將100ng／mlHMGBl加入培養(yǎng)基后培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間；根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入HMGBl濃度將Jurkat細(xì)胞分為0(正常組)、10、100、1000ng／ml組，加入相應(yīng)濃度HMGBl連續(xù)培養(yǎng)24h。采用CCK8法檢測各組Jurkat細(xì)胞增殖情況，熒光定量一聚合酶鏈反

5、應(yīng)(RT—PCR)檢測細(xì)胞樣本中p53、p21及泛素蛋白酶小鼠雙微體蛋白(murinedoubleminute2，mdm2)mRNA表達(dá)水平，Westernblot檢測磷酸化p53及p53、p21、mdm2的蛋白表達(dá)水平。2)將載有p53shRNA表達(dá)質(zhì)粒和空白載體的慢病毒轉(zhuǎn)染入Jurkat細(xì)胞中。加入嘌呤霉素對細(xì)胞進(jìn)行篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。將以上2種細(xì)胞分別分為對照組和HMGBl組，加入100ng／mlHMGBl培養(yǎng)24h。CCK

6、8法檢測細(xì)胞增殖，RT—PCR、Westernblot法分別檢測細(xì)胞樣本中p53mRNA、磷酸化p53和p53蛋白的表達(dá)水平；提取細(xì)胞核蛋白后檢測活化T細(xì)胞核因子(nuclearfactorofactivatedTcells，NFAT)活性；留取上清采用ELISA法檢測細(xì)胞因子IL2、IL一4、IFN吖的水平：將細(xì)胞用AnnxinV／7一AAD染色后，利用流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞比率，并檢測凋亡相關(guān)因子B淋巴細(xì)胞瘤一2(Bcelllymp