22854.mirna23a在c2c12細(xì)胞成肌分化過程中的調(diào)節(jié)作用研究

1、學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學(xué)位是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作和取得的研究成果。本論文中除引文外，所有實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)和有關(guān)材料均是真實(shí)的。本論文中除引文和致謝的內(nèi)容外，不包含其他人或其它機(jī)構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。其他同志對本研究所做的貢獻(xiàn)均已在論文中作了聲明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名：王確日期：Ⅵ『f3口學(xué)位論文使用授權(quán)聲明研究生在校攻讀學(xué)位期間論文工作的知識產(chǎn)權(quán)單位屬南京師范大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保存本學(xué)位論文的電子和紙質(zhì)

2、文檔，可以借閱或上網(wǎng)公布本學(xué)位論文的部。分或全部內(nèi)容，可以采用影印、復(fù)印等手段保存、匯編本學(xué)位論文。學(xué)?？梢韵驀矣嘘P(guān)機(jī)關(guān)或機(jī)構(gòu)送交論文的電子和紙質(zhì)文檔，允許論文被查閱和借閱。(保密論文在解密后遵守此規(guī)定)保密論文注釋：本學(xué)位論文屬于保密論文，保密期限為年。學(xué)位論文作者簽名：王m日期：p毗St1。指導(dǎo)教師簽名：日期：腳硝伽If亨’而摘要摘要脊椎動物的肌肉分化受多種轉(zhuǎn)錄因子的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，目前，研究發(fā)現(xiàn)很多基因，包括生長因子、調(diào)節(jié)蛋白、

3、受體以及轉(zhuǎn)錄因子都參與了肌分化的調(diào)節(jié)。多條信號通路也可以正向或負(fù)向調(diào)節(jié)肌分化。近年的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA(miRNA)對肌肉發(fā)育進(jìn)行精細(xì)的調(diào)節(jié)，是調(diào)節(jié)肌肉分化發(fā)育的一個(gè)新層次。miRNA是一類小非編碼RNA，大小約22nt，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的miRNA主要調(diào)節(jié)肌肉分化發(fā)育的中間過程，例如miR133、miR206和miR214等。本文通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)成體動物骨骼肌的重要結(jié)構(gòu)和功能蛋白一三種快肌肌球蛋白重

4、鏈(myosinheavychain，Myhl，Myh2，Myh4)mRNA的3’UTR存在一種miRNA23a結(jié)合序列。我們據(jù)此進(jìn)行了以下研究：一、首先構(gòu)建了miRNA23a的真核表達(dá)載體pIRES2。EGFPmiRNA23a，在pGL3promoter螢光素酶基因的3’端插入此三種靶基因mRNA的3’UTR的mRNA結(jié)合序列。二者共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA23a可以顯著抑制報(bào)告基因的表達(dá)，提示它們?yōu)閙iRNA23

5、a的靶基因。二、小鼠成肌細(xì)胞C2C12在體外可誘導(dǎo)終末分化為肌肉細(xì)胞。本文應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT。PCR方法分析了C2C12細(xì)胞分化過程中miRNA23a的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA23a在增殖的細(xì)胞中存在低水平表達(dá)，在誘導(dǎo)分化的第1天至第3天持續(xù)降低，第5天時(shí)miR_NA23a達(dá)到一個(gè)高水平，而在此過程中C2C12細(xì)胞被誘導(dǎo)肌分化成熟，肌球蛋白重鏈(MyosinheavychaillMHC)的蛋白表達(dá)量增加，提示C2C12細(xì)胞中miRNA

6、23a可能通過調(diào)節(jié)MHC的表達(dá)參與了肌分化。三、應(yīng)用miRNA23a的類似物(mimic)和抑制劑(inhibitor)，證實(shí)其對于C2C12細(xì)胞的肌性分化確實(shí)具有調(diào)節(jié)作用。miRNA23a的血TIllC轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞中MHC的蛋白表達(dá)水平明顯降低，而mRNA的轉(zhuǎn)錄水平不被抑制，肌性分化受到抑制。說明miRNA23a作用于翻譯水平，在轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有作用。四、成肌細(xì)胞可正常增殖，在分化條件下從細(xì)胞周期退出，進(jìn)入分化過程。BrdU是一種核苷類

7、似物，在細(xì)胞周期的S期可參入DNA鏈。本文應(yīng)用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)分化的C2C12細(xì)胞中，mimic轉(zhuǎn)染細(xì)胞BrdU的參入水平明顯高于對照組，說明miRNA一23a促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，與以上的抑制分化結(jié)果一致。五、已有的研究發(fā)現(xiàn)，在不同的細(xì)胞中，miRNA23a通過調(diào)節(jié)不同的靶基因發(fā)揮不同的功能。我們通過生物信息學(xué)分析也發(fā)現(xiàn)，與肌肉分化相關(guān)的一些調(diào)節(jié)因子或功能蛋白如MEF2C及Muff等也存在miRNA23a的互補(bǔ)結(jié)合序列。本文對mi