Sema4C基因在成肌分化過(guò)程中的表達(dá)、功能及作用機(jī)制研究.pdf

1、人Sema4C基因是從人胎腦中克隆分離出的一個(gè)Ⅳ型跨膜Semaphorin家族新成員，這個(gè)基因由13個(gè)外顯子組成，染色體定位于2q11.2，該基因編碼833個(gè)氨基酸，分子量約為92.6kD，為單次跨膜蛋白。本研究主要圍繞Sema4C基因的亞細(xì)胞定位、組織表達(dá)、生物學(xué)功能及其作用機(jī)理展開(kāi)系統(tǒng)研究。 本研究首先通過(guò)缺失體研究表明，Sema4C分子的胞外段(包括Sema，結(jié)構(gòu)域和PSI結(jié)構(gòu)域)的完整性是Sema4C蛋白進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆g后

2、修飾和亞細(xì)胞定位所必需的。原位雜交和免疫組化的結(jié)果表明，Sema4C基因在E11.5小鼠胚胎的前腦、眼原基、背根神經(jīng)節(jié)和動(dòng)脈弓中均有表達(dá)；E13.5小鼠胚胎除以上部位以外在上肢肢芽中也有部分表達(dá)。在成年小鼠的大腦皮層、小腦蒲肯野纖維層、視網(wǎng)膜視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和腎小管上皮細(xì)胞層中Sema4C均有較高表達(dá)，而在肌肉、心臟、肺、脾和肝臟等組織中表達(dá)量比較低或未檢測(cè)到表達(dá)。以上結(jié)果提示我們，Sema4C不僅在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮經(jīng)典作用，而且可能在

3、神經(jīng)系統(tǒng)之外的其他組織諸如骨骼肌發(fā)育過(guò)程中也可能擔(dān)當(dāng)著某種角色。 為驗(yàn)證Sema4C是否在骨骼肌發(fā)育和成肌分化過(guò)程中發(fā)揮作用，我們首先進(jìn)行了成肌細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，并建立了在體大鼠骨骼肌損傷修復(fù)的動(dòng)物模型，利用RT-PCR和Western blot的方法分別在mRNA和蛋白水平檢測(cè)了Sema4C在體內(nèi)外成肌、分化過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果表明，Sema4C在體內(nèi)外成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中其表達(dá)都顯著上調(diào)。為了深入研究Sema4C對(duì)成

4、肌細(xì)胞C2C12增殖分化的影響，分別構(gòu)建了人Sema4C基因的真核表達(dá)質(zhì)粒和重組Ad5-Sema4C腺病毒載體用于穩(wěn)定和瞬時(shí)過(guò)表達(dá)外源性人Sema4C基因。研究顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時(shí)過(guò)表達(dá)Sema4C基因都能明顯促進(jìn)細(xì)胞的終末分化，肌肉分化特異分子肌球蛋白和肌酸激酶等表達(dá)上調(diào)；成肌轉(zhuǎn)錄因子myogenin的表達(dá)增強(qiáng)。而通過(guò)RNAi方法特異性降低Sema4C基因的表達(dá)則能顯著抑制C2C12細(xì)胞的終末成肌分化，并降低肌球蛋白myosin和成肌

5、轉(zhuǎn)錄因子myogenin的表達(dá)。 在研究過(guò)程中，還發(fā)現(xiàn)在C2C12中過(guò)表達(dá)Sema4C能特異性地引起p38 MAPK的磷酸化，而MAPK信號(hào)通路中ERK1/2和JNK的磷酸化水平不受影響；p38特異性化學(xué)抑制劑SB203580能夠阻斷Sema4C在成肌分化中的促分化效應(yīng)。此外，在C2C12成肌細(xì)胞分化過(guò)程中通過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染的方法特異性降低Sema4C基因的表達(dá)，伴隨著肌管融合的減少，p38的磷酸化也明顯受到抑制。我們通過(guò)雙熒光