牦牛miR--487b和miR--433對C2C12增殖和分化調控作用的研究.pdf

1、骨骼肌正常發(fā)育是機體維持一系列重要生命活動的基礎，而成肌細胞的增殖與分化是骨骼肌發(fā)育的關鍵環(huán)節(jié)，因此研究成肌細胞增殖與分化的調控網絡是發(fā)育生物學的熱點研究領域。成肌細胞的增殖與分化受到一系列轉錄因子以及miRNAs的調控。miRNAs一類長度為18-22nt的非編碼小RNA，其通過與靶mRNA結合來下調靶基因表達，進而參與多種生物學過程的調控。諸多研究表明，miRNAs在骨骼肌發(fā)育過程中起到重要的調控作用。基于實驗室前期對大通牦牛胎牛和

2、成年牦牛背最長肌miRNAs高通量測序，發(fā)現(xiàn)miR-487b和miR-433在牦牛胎牛背最長肌中的表達極顯著高于成年牦牛，推測這兩個miRNAs可能參與調控骨骼肌的生長發(fā)育。因此本研究將小鼠成肌細胞系(C2C12)作為細胞模型，來探究miR-487b和miR-433在成肌細胞增殖和分化過程中的作用，為進一步完善骨骼肌發(fā)育調控網絡提供理論依據。
　　本研究通過轉染miRNA mimics或inhibitor實現(xiàn)miRNAs的過表達或

3、抑制表達，研究牦牛miR-487b和miR-433在C2C12細胞增殖與分化過程中的功能。運用雙熒光素酶報告基因驗證PITX2是miR-487b的直接靶基因，進一步闡明miR-487b在骨骼肌發(fā)育過程中的調控機制。主要結果如下:
　　(1)克隆測序獲得牦牛miR-487b和miR-433成熟序列，保守性分析發(fā)現(xiàn)，miR-487b和miR-433成熟序列在各物種間高度保守。小鼠組織表達譜結果顯示，miR-487b和miR-433在骨

4、骼肌中表達豐度最高。
　　(2)miR-487b和miR-433在C2C12細胞增殖階段表達量逐漸上調。過表達miR-487b和miR-433后，增殖標記基因PCNA、CCNB1和MKI67mRNA表達量顯著增加，PCNA蛋白表達量也顯著提高。CCK-8法檢測后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，過表達miR-487b和miR-433組均能顯著促進細胞增殖。相反，抑制miR-487b和miR-433后，PCNA、CCNB1和MKI67表達量下調，

5、且C2C12細胞增殖活性顯著降低。表明miR-487b、miR-433促進C2C12細胞增殖。
　　(3)體外成功構建C2C12成肌細胞誘導分化體系，隨著誘導分化時間延長，miR-487b和miR-433表達量呈上升趨勢。過表達miR-487b和miR-433后，分化標志基因MYOD、MYOG、MYHC在mRNA和蛋白水平均顯著降低。相反，抑制miR-487b、miR-433表達后，MYOD、MYOG、MYHC在轉錄和蛋白水平上升