奶山羊乳腺上皮細(xì)胞系的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、為了建立能用于乳腺特異表達(dá)基因構(gòu)件質(zhì)量檢驗(yàn)的山羊乳腺上皮細(xì)胞系,根據(jù)已發(fā)表的SV40病毒T基因序列設(shè)計(jì)并合成PCR引物,以整合有SV40 DNA早期基因區(qū)的COS-1細(xì)胞基因組DNA為模板,用高保真聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增SV40 T基因.凝膠電泳結(jié)果顯示,擴(kuò)增產(chǎn)物為2.5kb的單一條帶,與預(yù)計(jì)大小相符.序列測(cè)定結(jié)果顯示,所獲序列與已發(fā)表的SV40 T基因的同源性大于99％.將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入剔除neo基因的真核表達(dá)載體pTarget,經(jīng)

2、XhoI和NdeI酶切鑒定出SV40 T基因以正確方向插入的重組表達(dá)質(zhì)粒pTarget-LT.用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將線性化的重組表達(dá)質(zhì)料pTarget-LT轉(zhuǎn)染入奶山羊原代乳腺上皮細(xì)胞,經(jīng)有限稀釋和反復(fù)傳代后獲得了轉(zhuǎn)化的細(xì)胞克隆.部分細(xì)胞克隆已在體外傳30代以上,它們保持正常乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)特征,在膠原基質(zhì)上能形成腺泡樣結(jié)構(gòu),但飽和密度和生長(zhǎng)速度明顯增加.用基因組DNA進(jìn)行的班點(diǎn)雜交試驗(yàn)結(jié)果證明,轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因組中整合有SV40 T基因.用

3、總RNA進(jìn)行的斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)證明,轉(zhuǎn)化細(xì)胞的β-酪蛋白基因能被正常轉(zhuǎn)錄.用自制的小鼠抗山羊β-酪蛋白免疫血清進(jìn)行的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)化細(xì)胞在催乳素、胰島素和氫化可的松共同誘導(dǎo)下,能保持原有的分泌內(nèi)源性β-酪蛋白的能力,其表達(dá)量最高達(dá)1μg/10<'4>個(gè)細(xì)胞.將含有LacZ報(bào)告基因的乳腺特異表達(dá)基因構(gòu)件pHC-LacZ和p205CLacZ3分別轉(zhuǎn)染入轉(zhuǎn)化細(xì)胞,經(jīng)酶組化染色試驗(yàn)證明,在催乳素、胰島素和氫化可的松的誘導(dǎo)下,報(bào)告基因能