非轉染人角膜上皮細胞系的建立、鑒定及其克隆化研究.pdf

1、角膜盲是常見的致盲眼病，在我國有超過400萬患者亟待治療。其中許多患者是由于人角膜上皮(Human Corneal Epithelium，HCEP)發(fā)生不可逆病變而致盲。盡管可以通過捐獻角膜移植來治愈，但限于捐獻角膜數量的嚴重不足，致使絕大多數患者無法重見光明。組織工程人角膜上皮(Tissue-engineered Human Corneal Epithelium，TE-HCEP)作為HCEP的等效替代物，是解決供體角膜不足、絕大多數H

2、CEP異?；颊邿o法復明問題的有效途徑。TE-HCEP體外重建的關鍵要素包括結構功能正常的HCEP種子細胞的獲得和具有理想生物相容性的載體支架的制備。其中如何獲得大量的符合用于TE-HCEP體外重建要求的種子細胞成為研究的熱點之一。連續(xù)性人角膜上皮細胞系能夠提供大量人角膜上皮細胞(Human Corneal Epithelial Cells，HCEPC)，被認為是種子細胞的理想來源，目前已經建立的HCEPC細胞系均為癌基因轉染的永生化細胞

3、系，因其潛在致瘤性，無法應用于臨床移植。用非轉染方法建立HCEPC細胞系能為TE-HCEP體外重建提供足量的正常細胞，但仍未見HCEPC未經轉染而建立細胞系的報道。為了解決TE-HCEP及全層角膜體外重建所需大量HCEP種子細胞的來源問題，本文利用非轉染方法建立HCEPC細胞系，進而從此細胞系通過克隆化培養(yǎng)篩選出形態(tài)結構和功能蛋白表達正常的單克隆細胞株，旨在為TE-HCEP及全層角膜的體外重建創(chuàng)造條件。
　　 為了建立非轉染HC

4、EPC細胞系，本文根據人角膜組織的結構特點，用0.25％胰蛋白酶液對撕下的人角膜上皮層進行酶解后，再將上皮面朝下直接貼于0.01％明膠處理的24孔板中，12 h后補加含bFGF、EGF、硫酸軟骨素、羧甲基殼多糖和Ⅳ型膠原的DMEM/F12完全培養(yǎng)液(20％胎牛血清)，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，啟動HCEPC的原代培養(yǎng)。在上述培養(yǎng)條件下，原代啟動3 d后即有細胞遷出，22 d即可長成細胞單層，細胞為典型的上皮樣細胞形態(tài)，且生長分

5、裂旺盛，能穩(wěn)定傳代，凍存后再復蘇的細胞依然可以維持良好的生長狀態(tài)和增殖能力。經過連續(xù)的繼代培養(yǎng)(已超過60代)，細胞生長狀況依然良好，完成了非轉染HCEPC細胞系的建立。
　　 對連續(xù)傳代HCEPC進行細胞屬性鑒定是確定所建立細胞系確為HCEPC細胞系的關鍵。本文對已建立的非轉染HCEPC細胞系第90代細胞進行了形態(tài)學觀察、生長特性檢測、染色體分析、細胞免疫熒光檢測和致瘤性實驗等鑒定。對細胞的形態(tài)學鑒定，包括光鏡和掃描電鏡觀察，

6、結果顯示該細胞系細胞具備典型上皮樣細胞形態(tài)，細胞表面富含微絨毛和偽足。生長特性分析結果顯示，該細胞系細胞群體倍增時間為40.56 h，細胞分裂以及代謝旺盛。染色體組型分析結果顯示，該細胞系細胞特征性染色體數目為2n=46，并且具備人染色體核型特征，其中出現了染色體數目的非整倍性。對HCEP特異性標志蛋白免疫熒光檢測結果顯示，該細胞系細胞具有細胞角蛋白K3、K12和K19的陽性表達，結合染色體組型分析結果，可以初步確定本文所建立的非轉染細

7、胞系確為HCEPC細胞系。致瘤性檢測結果顯示，該細胞系細胞無任何致瘤性。由此可見，本文建立的細胞系是非轉染、無致瘤性的HCEPC細胞系。
　　 為了篩選出染色體數目正常的HCEPC以用HCEP種子細胞，本文利用已建立的非轉染HCEPC細胞系進行了克隆化研究。采用有限稀釋法，以小鼠腹腔巨噬細胞為飼養(yǎng)層細胞對HCEPC細胞系細胞進行克隆化擴增，挑選出單克隆細胞株進行染色體組型分析，篩選一株具有2n=46正常核型的單克隆細胞株，命名為

8、HCEP-5A1單克隆細胞株。該單克隆細胞株細胞經凍存然后復蘇后其生長狀態(tài)保持良好。通過免疫熒光檢測該單克隆細胞株細胞的HCEP標志蛋白、連接蛋白和功能蛋白的表達情況，結果顯示其具有K3和K12的陽性表達，證明其HCEPC屬性；具有間隙連接蛋白-43和整聯蛋白β1的陽性表達，說明其具備形成細胞通訊連接和錨定連接的潛能，可形成完整的人角膜上皮層；具有鈣泵PMCA1/4蛋白和14-3-3s蛋白的陽性表達，說明其具備發(fā)揮正常HCEPC的跨膜運