版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、小RNA是生物體生命活動的重要調控因子,在生物的生長發(fā)育中發(fā)揮非常重要的作用。部分小RNA行使基因調控功能的過程依賴于Argonaute(AGO)蛋白等結合形成的RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC),在RISC復合體的作用下小RNA能與靶基因結合并對靶基因進行剪切或抑制其翻譯。因此,通常應用免疫共沉淀AGO蛋白的方法將與之結合的小RNA及靶基因一起分離,再通過高通量測序和生物信息學
2、分析方法對這些RNA進行分析,并通過后續(xù)實驗進行驗證,探究小RNA與調控靶基因之間的相關性。前期研究我們利用免疫共沉淀成功分離了長度為200nt以上的與BmAGO2結合的小RNA,并對其進行了高通量測序和生物信息學分析,分析發(fā)現(xiàn)BmAGO2結合的小RNA中,轉座子(Transposable elements,TEs)來源的小RNA占總RNA的47.78%。因此本研究通過Northern Blotting的方法對轉座子來源的小RNA進行進
3、一步鑒定與表達分析,并利用真核表達和RNA干擾(RNAi)方法上調和下調AGO蛋白,分析AGO蛋白上調和下調表達對TEs表達的影響,闡明RISC復合體對TEs的調控功能。
首先用生物學軟件將前期研究得到的BmAGO2結合小RNA與 BmAGO2結合的1,694條TEs進行匹配,得到家蠶中TEs與小RNA的匹配圖譜,表明這些小RNA來源于TEs,命名為TEs來源小RNA(TE-siRNA),它們可能為類似于siRNA的新型小RN
4、A分子。合成小RNA特異探針,Northern Blotting鑒定桿狀病毒感染家蠶BmN細胞和正常BmN細胞中的TE-siRNA。檢測結果顯示,大部分TE-siRNA被成功檢測到,如TE-siRNA413、TE-siRNA610、TE-siRNA479、TE-siRNA649、TE-siRNA134和TE-siRNA671等,在這些被檢測出的TE-siRNA中,除TE-siRNA479外,其他小RNA均位于轉座子bm1645上,表明b
5、m1645可能為一個產生小RNA的“pool”。和正常細胞相比,部分TE-siRNA在桿狀病毒感染細胞中表達水平上調,表明這些小RNA可能和病毒侵染相關,而部分TE-siRNA則維持了相對穩(wěn)定的表達水平。進一步Northern Blotting鑒定正常和桿狀病毒感染五齡蠶、蛹、蛾三個時期中的TE-siRNA表達情況和正常卵中的TE-siRNA表達情況,結果顯示,在家蠶的不同生長時期均能檢測到部分TE-siRNA的表達,但各個時期檢測到的
6、TE-siRNA并不完全相同,表明某些TE-siRNA只存在于特定的家蠶生長發(fā)育時期,未檢測到的TE-siRNA也有可能由于含量太低導致信號弱而未被檢測出。TE-siRNA在家蠶發(fā)育時期的差異表達表明,其可能在家蠶特定的發(fā)育時期行使特定的基因調控功能,還有待進一步研究。
和miRNA或siRNA通路相似,TE-siRNA和BmAGO2結合可能形成RISC復合物從而調控靶向TEs的表達。因此我們進一步開展了BmAGO2過表達對T
7、Es基因轉錄水平影響的研究。轉染重組真核表達載體pIEX-1-BmAGO2到家蠶細胞中,qRT-PCR檢測表明成功上調BmAGO2基因的表達水平,同樣應用qRT-PCR檢測此時細胞中TEs的轉錄水平變化,結果顯示,BmAGO2轉錄水平上調后可導致R1-3_BM、M19755、AK380858.1和Mariner-1-BM等轉座子的轉錄水平出現(xiàn)下調,而大量BmAGO2結合的TE-siRNA來源于這些下調的轉座子中,表明BmAGO2介導的R
8、ISC復合體可能結合TE-siRNA從而調控這些轉座子的表達,其機制可能類似于siRNA的基因調控通路,具體機制還有待進一步研究。另外,我們還研究了Argonaute蛋白家族的其他兩個成員BmAGO3和BmSIWI的下調表達對TEs基因轉錄水平的影響。應用RNAi干擾技術,將體外合成的雙鏈RNA-BmAGO3-dsRNA和BmSIWI-dsRNA轉染到家蠶細胞中使細胞中BmAGO3和BmSIWI的轉錄水平下調,應用qRT-PCR檢測此時
9、細胞中TEs轉錄水平的變化,結果顯示,BmAGO3基因的下調可導致bm1157、AK380858.1和R1-3_BM等轉座子轉錄水平發(fā)生上調;而 BmSIWI基因的下調可導致 bm1157、AB480244.1、L1BM、AK380858.1、Mariner-1-BM、R1-3_BM和M19755等轉座子轉錄水平發(fā)生上調,表明TE-siRNA分子可能和不同的AGO蛋白結合行使調控TEs的功能。
另外,我們還檢測了家蠶細胞中桿狀
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 家蠶MITE轉座子的鑒定、進化和功能以及家蠶轉座子的進化動力學研究.pdf
- 毛竹MLE轉座子轉座活性的鑒定與分析.pdf
- 家蠶SINE轉座子的全基因組鑒定及進化分析.pdf
- 家蠶轉座子數(shù)據庫BmTEdb的構建.pdf
- 基于轉座子聚集性的轉座子預測工具.pdf
- 基于piggyBac轉座子的家蠶定向遺傳轉化研究.pdf
- 家蠶基因組中轉座子的水平轉移.pdf
- 非轉座子載體介導的轉基因家蠶的研究.pdf
- 家蠶微孢子蟲LTR反轉座子的活性研究.pdf
- 家蠶內源性piRNA促進家蠶piggyBac轉座子的穩(wěn)定性.pdf
- 毛竹Mariner-like轉座子的轉座特性分析.pdf
- PB轉座子和To12轉座子介導基因長期表達的研究.pdf
- 桑樹全基因組轉座子的鑒定及特征分析.pdf
- 家蠶一類非典型SINE轉座子(BmSINE-A3B)的鑒定、進化與功能分析.pdf
- 家蠶Bm1、BmSE轉座子對基因表達調控的研究.pdf
- 3738.竹亞科enspm類轉座子系統(tǒng)進化分析及mle轉座子標簽的構建
- 基因組重測序作物的新轉座子鑒定及特征分析.pdf
- 家蠶五齡幼蟲BmAGO2蛋白結合Te-siRNA的鑒定及其對轉座子Bm1645表達調控的研究.pdf
- 蘿卜LTR逆轉座子分離鑒定及IRAP標記開發(fā).pdf
- 竹亞科轉座子的克隆及特征分析.pdf
評論
0/150
提交評論