轉(zhuǎn)Mad1基因球孢白僵菌工程菌株的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、在全球關(guān)注綠色無公害農(nóng)業(yè)的大前提下，微生物農(nóng)藥得到了廣泛的關(guān)注和長足的發(fā)展，雖然存在著寄主范圍廣、致病力強、對人畜無害等優(yōu)點，不過缺點也是顯而易見的，如致病潛伏期長，殺蟲時效性較差、對環(huán)境條件要求高等缺點，使得微生物殺蟲劑的推廣仍然受到限制。因此利用基因工程等技術(shù)手段改造真菌，獲得具有更高殺蟲力并適應(yīng)市場需求的微生物殺蟲劑將具有重要的應(yīng)用價值。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）作為重要的昆蟲病原真菌在害蟲的生物防治中發(fā)揮

2、著重要作用。目前許多球孢白僵菌的基因工程研究主要集中在毒力直接相關(guān)基因的轉(zhuǎn)化和表達，如蛋白酶基因、幾丁質(zhì)酶基因、毒素基因等，存在著一定的生物安全性問題，本研究所導(dǎo)入的外源基因來自于金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae），并且該基因非直接毒素基因，而是通過空氣表達增加蟲生真菌黏著性，促進孢子對昆蟲體壁的吸附，從而增加毒力，縮短作用時間，對未來白僵菌基因工程菌株的選育提供了材料。
　　本研究克隆了來源于生防真菌綠

3、僵菌的黏著蛋白基因Mad1，構(gòu)建到遺傳轉(zhuǎn)化載體上。采用溶壁酶和β-巰基乙醇裂解白僵菌細胞壁，得到的原生質(zhì)體濃度達到108sp/mL，再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)經(jīng)計算其再生率為15％。使用抗殺菌劑萎銹靈基因Carboxin做為抗性篩選標(biāo)記，經(jīng)抗性濃度篩選確定其抗性終濃度為180ng/mL。利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系導(dǎo)入受體球孢白僵菌菌株，獲得轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過繼代培養(yǎng)及分子檢測，獲得遺傳穩(wěn)定的基因工程菌株。
　　利用蝗蟲內(nèi)翅及洋蔥表皮進行

4、吸附試驗進行了工程菌株的生物學(xué)功能鑒定。研究結(jié)果表明，野生型和工程菌的分生孢子對于洋蔥表皮的吸附量并無明顯差異，而工程菌的分生孢子對蝗蟲翅膀的吸附則顯著高于野生型，表明Mad1基因的導(dǎo)入能夠增加球孢白僵菌對昆蟲組織的吸附，而對植物表皮組織不存在吸附能力；對亞洲玉米螟幼蟲室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明轉(zhuǎn)化后的工程菌株 LT50值（3.278±0.346天）要比野生型（4.972±0.147天）縮短1天。殺蟲率方面轉(zhuǎn)化后的工程菌株殺蟲校正死亡率在第七