球孢白僵菌T-DNA插入突變體Mu301的鑒定及分析.pdf

1、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一種重要的昆蟲(chóng)病原真菌，具有主動(dòng)侵染寄主、循環(huán)侵染以及寄主不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)林害蟲(chóng)的防治中占據(jù)重要地位。但存在致病潛伏期過(guò)長(zhǎng)及防效不穩(wěn)定等缺陷，使其推廣使用受到制約。目前，球孢白僵菌發(fā)育分化和侵染致病的分子機(jī)理等研究相對(duì)較少，在分子水平上闡明其侵染致病過(guò)程中相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)功能，對(duì)充分挖掘其防治潛力，促進(jìn)真菌殺蟲(chóng)劑廣泛運(yùn)用有重要意義。
　　 在球孢白僵菌的功能基因的研究中，

2、分子標(biāo)簽技術(shù)是一種有效的工具。本論文構(gòu)建了球孢白僵菌T-DNA隨機(jī)插入突變體庫(kù)，并從中篩選出一株菌落生長(zhǎng)緩慢，毒力降低的突變體Mu301，利用Sitefinding-PCR法克隆了T-DNA標(biāo)簽基因，發(fā)現(xiàn)該基因與3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶β亞基有較高的同源性。
　　 論文的主要研究結(jié)果如下：1.篩選獲得突變體
　　 構(gòu)建了球孢白僵菌T-DNA隨機(jī)插入突變體庫(kù)，從中篩選到菌落生長(zhǎng)緩慢，致病時(shí)間顯著推遲的突變體Mu301。3

3、次連續(xù)傳代分析表明，該突變性狀能穩(wěn)定遺傳。2.3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶β亞基的基因克隆與特征分析
　　 經(jīng)過(guò)連續(xù)3次Sitefinding-PCR方法克隆突變體Mu301的T-DNA插入位點(diǎn)左翼2760bp的核苷酸序列，比對(duì)發(fā)現(xiàn)該片段與Aspergillus nidulans中3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶β亞基的編碼基因MCCB有83％同源性。序列分析發(fā)現(xiàn)，T-DNA元件插入在MCCB基因的起始密碼子ATG上游-485的位置，推

4、測(cè)此種插入方式，破壞了MCCB的啟動(dòng)子區(qū)域。此段序列覆蓋了MCCB的全長(zhǎng)編碼框，其中有一個(gè)76bp的內(nèi)含子，此MCCB終止密碼子為T(mén)AA。3.MCCB基因的同源敲除
　　 為了進(jìn)一步確定MCCB的功能，分離了T-DNA標(biāo)簽基因，構(gòu)建了MCCB同源重組載體pPZPtk8.10-MCCB51-bar-MCCB31。應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化球孢白僵菌，獲得了MCCB基因的同源敲除突變菌株⊿mccB111，⊿mccB205和⊿mccB277，