水稻bHLH轉(zhuǎn)錄因子Os11g39000功能的初步研究.pdf

1、bHLH轉(zhuǎn)錄因子是真核生物蛋白質(zhì)中的一個(gè)大家族，其成員在動(dòng)植物界行使著多種重要的功能。目前，植物中還有許多 bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員的功能仍不清楚。為了探究bHLH轉(zhuǎn)錄因子對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育的影響，本研究特選取水稻bHLH轉(zhuǎn)錄因子 Os11g39000，采用合成型轉(zhuǎn)錄因子的基因工程手段對(duì)該轉(zhuǎn)錄因子的功能進(jìn)行了初步研究。具體研究結(jié)果如下：
　　(1)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Os11g39000含有1個(gè)典型的HLH結(jié)構(gòu)域，而不含有ba

2、sic結(jié)構(gòu)域，表明該轉(zhuǎn)錄因子屬于非典型的bHLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族成員。啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)，Os11g39000編碼基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有ABA，GA和IAA等多種激素應(yīng)答元件。
　　(2)酵母雙雜交和X-gal顯色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子 Os11g39000可以形成同源蛋白聚合體。隨機(jī)結(jié)合位點(diǎn)篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Os11g39000可以與DNA結(jié)合，并且其結(jié)合位點(diǎn)初步確定為TT/CG/CACC/GT/C。
　　(3)經(jīng) NaCl

3、，PEG6000和各種激素對(duì)野生型水稻 Kitaake處理，并對(duì)Os11g39000基因表達(dá)量進(jìn)行分析檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該基因表達(dá)量在 IAA處理時(shí)變化最顯著，說明該基因可能參與了對(duì)生長(zhǎng)素的響應(yīng)途徑。對(duì)水稻幼苗期和抽穗期Os11g39000基因的組織表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，Os11g39000基因主要在葉片和根中表達(dá)，推測(cè)該基因可能在葉和根的發(fā)育調(diào)控中起作用。
　　(4)構(gòu)建了Ubi::EAR-Os11g39000，35S::Os11g3900

4、0和ProOs11g39000::GUS重組質(zhì)粒，并通過農(nóng)桿菌侵染水稻愈傷組織得到了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因株系。經(jīng) DNA和RNA水平的分子鑒定，篩選出2個(gè)Os11g39000轉(zhuǎn)錄功能抑制型的陽性轉(zhuǎn)基因株系 Ubi::EAR-Os11g39000-10和Ubi::EAR-Os11g39000-11。通過水培實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ubi::EAR-Os11g39000相對(duì)于野生型根長(zhǎng)更短，表現(xiàn)為明顯的根部發(fā)育缺陷，表明Os11g39000在水稻根的發(fā)育中起調(diào)控

5、作用。
　　(5)使用IAA對(duì)野生型和轉(zhuǎn)錄功能抑制型轉(zhuǎn)基因植株 Ubi::EAR-Os11g39000進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)高濃度的IAA不敏感，說明抑制Os11g39000的轉(zhuǎn)錄活性會(huì)導(dǎo)致水稻對(duì)生長(zhǎng)素的應(yīng)答受損，并且該轉(zhuǎn)錄因子在生長(zhǎng)素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中有重要作用。Q-PCR分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)生長(zhǎng)素合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因 OsYUCCA1，OsYUCCA4，OsARF23和OsARF24的表達(dá)量顯著上升，而生長(zhǎng)素極性運(yùn)