家蠶絲腺特異表達(dá)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子Bmsage和Bmdimm的功能研究.pdf

1、家蠶絲腺是一種高度特異化的器官，能夠高效特異地合成絲蛋白，根據(jù)其結(jié)構(gòu)可以分為前部、中部和后部絲腺。前部絲腺不合成蛋白，中部絲腺合成絲膠蛋白，后部絲腺合成絲素蛋白，絲素蛋白分為絲素重鏈蛋白（fib-H）、絲素輕鏈蛋白(fib-L)和P25蛋白，它們按6∶6∶1組合形成多聚體蛋白。在幼蟲各齡眠期和變態(tài)期，家蠶只合成少量或不合成絲蛋白，進(jìn)入五齡盛食期，絲素和絲膠基因的轉(zhuǎn)錄水平大大提高，絲蛋白隨即被大量合成。研究表明，絲蛋白基因的表達(dá)主要是在轉(zhuǎn)

2、錄調(diào)控水平進(jìn)行的，目前研究學(xué)者已經(jīng)在家蠶絲腺中發(fā)現(xiàn)了大量的轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子廣泛的參與絲腺器官的發(fā)育、絲蛋白基因的轉(zhuǎn)錄以及絲腺細(xì)胞的凋亡等生命過(guò)程。家蠶基因組數(shù)據(jù)和基因芯片數(shù)據(jù)的公布，為研究家蠶絲腺特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子提供了信息平臺(tái)。本研究根據(jù)之前發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)在家蠶絲腺特異表達(dá)的并且含有bHLH結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子—Bmsage和Bmdimm，采用克隆、表達(dá)、RT-PCR、western blot等技術(shù)對(duì)Bmsage和Bmdimm生物進(jìn)化關(guān)系

3、、轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白質(zhì)水平的組織表達(dá)模式進(jìn)行了分析和研究。同時(shí)，在細(xì)胞水平探討了它們?cè)诮z素重鏈蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用并且從分子生物學(xué)水平探討了保幼激素在家蠶絲蛋白合成過(guò)程中的作用，獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.家蠶Bmsage和Bmdimm原核表達(dá)及表達(dá)模式分析
　　進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，Bmsage同果蠅sage和小鼠Mesp等因子具有較高的相似性;Bmdimm同果蠅dimmed和小鼠Mist等因子具有較高的相似性。因此，我

4、們認(rèn)為Bmsage屬于bHLH家族中的Mesp亞家族;而Bmdimm則同Mist因子一樣屬于Atonal亞家族。另外，將其克隆并原核表達(dá)了Bmsage和Bmdimm重組蛋白，其中Bmsage在37℃溫度下以包涵體形式表達(dá)，Bmdimm全長(zhǎng)在該表達(dá)系統(tǒng)下不表達(dá)。對(duì)Bmdimm進(jìn)行多種方式的截?cái)?，發(fā)現(xiàn)第一種截短形式(187-636 aa)的蛋白以可溶蛋白形式在上清表達(dá)。通過(guò)各種蛋白柱的分離純化，獲得Bmsage和Bmdimm的純化蛋白。用這

5、兩個(gè)純化蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，效價(jià)均達(dá)到了512 k而且純度均在95％以上，表明可以用于后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。組織表達(dá)分析表明:在轉(zhuǎn)錄水平上，Bmsage和Bmdimm在家蠶絲腺組織中表達(dá)，Bmdimm在中腸中存在少量表達(dá)，這與家蠶芯片表達(dá)譜分析的數(shù)據(jù)基本一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在前部、中部和后部絲腺中均能檢測(cè)到Bmsage和Bmdimm的轉(zhuǎn)錄本存在;在蛋白質(zhì)水平上，Bmsage和Bmdimm只存在于絲腺組織中，而且只在中部和后部絲腺

6、，其中Bmdimm在后部絲腺的量明顯高于中部絲腺。不同時(shí)期RT-PCR分析表明，Bmsage和Bmdimm的表達(dá)從四眠中后期開始逐漸升高，到五齡6-7天達(dá)到最高，隨后到成熟期表達(dá)逐漸降低直到化蛹表達(dá)終止，這一表達(dá)模式與絲素重鏈基因(fib-H)相似。通過(guò)對(duì)低絲量品種大造和高絲量品種872絲腺中Bmsage、Bmdimm和fib-H的轉(zhuǎn)錄本qRT-PCR定量分析發(fā)現(xiàn)，Bmsage和Bmdimm基因在872的后部絲腺表達(dá)量顯著高于大造，而且

7、Bmdimm基因在后部絲腺表達(dá)量同樣高于中部絲腺，而872品種后部絲腺中fib-H的轉(zhuǎn)錄本約是大造的3倍，結(jié)果表明Bmsage和Bmdimm極有可能參與fib-H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　2.Bmsage對(duì)家蠶絲素重鏈基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
　　轉(zhuǎn)錄因子一般是協(xié)同其它因子對(duì)下游靶標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。Western blot分析發(fā)現(xiàn)，家蠶絲腺fork head因子SGF1和Bmsage一樣均在家蠶中部和后部絲腺表達(dá)，為證實(shí)Bmsage是

8、否與SGF1存在相互作用，利用體外重組蛋白進(jìn)行了far-western blot和ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，Bmsage能夠在體外與SGF1相互作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，在家蠶胚胎細(xì)胞系中進(jìn)行了免疫熒光和免疫共沉淀(co-IP)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示與體外實(shí)驗(yàn)一致，表明Bmsage和SGF1能夠相互作用。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)結(jié)果顯示，重組表達(dá)的Bmsage和SGF1蛋白在體外孵育后，通過(guò)SGF1結(jié)合到fib-H啟動(dòng)子上的近端區(qū)A和B位點(diǎn)上。

9、fib-H啟動(dòng)子缺失實(shí)驗(yàn)表明A和B位點(diǎn)是SGF1對(duì)fib-H的表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)，這些表明Bmsage和SGF1蛋白形成復(fù)合物，通過(guò)SGF1結(jié)合到A和B位點(diǎn)上調(diào)控fib-H的表達(dá)。
　　3.Bmdimm對(duì)家蠶絲素重鏈基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
　　為分析fib-H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，利用家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)下載其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約1000 bp區(qū)域，預(yù)測(cè)分析顯示這段啟動(dòng)子區(qū)域中除了存在近端區(qū)和遠(yuǎn)端區(qū)的A、B、C、D和E位點(diǎn)外，還存在著E-box、

10、βFTZ-F1和POU等轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)結(jié)果顯示，Bmdimm能夠與fib-H啟動(dòng)子區(qū)域中的E-box(CAAATG)元件結(jié)合，EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)果。Bmdimm除了與CAAATG元件結(jié)合外還可以與其它幾種形式的E-box結(jié)合，如CAATTG、CAACTG等，這表明Bmdimm結(jié)合位點(diǎn)并不是唯一的，暗示著可能參與其它基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如fib-L和P25等。定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Bmdimm堿性區(qū)域保

11、守的第113位精氨酸是結(jié)合CAAATG元件的關(guān)鍵位點(diǎn)。啟動(dòng)子缺失實(shí)驗(yàn)顯示，缺失了該E-box位點(diǎn)的fib-H啟動(dòng)子在過(guò)表達(dá)Bmdimm后的活性幾乎沒有變化而正常的啟動(dòng)子活性顯著增加，表明Bmdimm可以通過(guò)該E-box位點(diǎn)調(diào)控fib-H基因的表達(dá)。bHLH轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)其bHLH結(jié)構(gòu)域相互作用形成同源或異源二聚體，然后通過(guò)二聚體中的一段保守堿性區(qū)域與特定的DNA序列進(jìn)行結(jié)合進(jìn)而調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)。為證實(shí)Bmdimm是否與Bmsage存

12、在相互作用，利用體外重組蛋白進(jìn)行了far-westem blot和ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，Bmdimm在體外能夠與Bmsage相互作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，在家蠶胚胎細(xì)胞系中進(jìn)行了免疫熒光和co-IP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示與體外實(shí)驗(yàn)一致，表明Bmdimm和Bmsage能夠相互作用。為了分析Bmdimm的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)分析了Bmdimm基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約2000 bp的啟動(dòng)子區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在fork head可能的反應(yīng)元件，暗示SGF1在

13、Bmdimm基因的表達(dá)中可能起著調(diào)控作用。EMSA實(shí)驗(yàn)表明SGF1可以與fork head元件結(jié)合，同時(shí)在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SGF1后，Bmdimm啟動(dòng)子活性明顯升高，而且qRT-PCR結(jié)果顯示Bmdimm在細(xì)胞中的表達(dá)量也明顯提高。
　　4.保幼激素對(duì)家蠶絲素基因的調(diào)控
　　通過(guò)對(duì)Bmdimm基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)得到多個(gè)與昆蟲激素相關(guān)的可能反應(yīng)元件，包括Kr，E-box，BR-C，E74A和FTZ-F1，這些元件已被證實(shí)可能是昆蟲激素

14、信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的重要轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合元件，調(diào)控下游目的基因的表達(dá)，尤其Kr位點(diǎn)是保幼激素早期響應(yīng)基因Kr-h1的潛在結(jié)合元件，暗示著Bmdimm基因可能受到保幼激素信號(hào)途徑的調(diào)控作用。用保幼激素類似物(JHA)處理五齡早期家蠶發(fā)現(xiàn)，家蠶五齡齡期經(jīng)過(guò)延長(zhǎng)2-3天;qRT-PCR結(jié)果顯示與對(duì)照相比f(wàn)ib-H基因及其調(diào)控因子Bmdimm基因的表達(dá)量在前期有所下降，隨著齡期發(fā)育逐漸升高，并出現(xiàn)延時(shí)表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，JH早期反應(yīng)基因BmKr-h1在前

15、期表達(dá)量升高，隨后隨著JH受體表達(dá)降低而降低，到五齡末期也出現(xiàn)延時(shí)表達(dá)。絲腺體外培養(yǎng)結(jié)果顯示BmKr-h1的表達(dá)趨勢(shì)與Bmdimm類似。在家蠶BmE細(xì)胞系中，用不同濃度的JHA誘導(dǎo)不同時(shí)間發(fā)現(xiàn)Bmdimm具有JH濃度和誘導(dǎo)時(shí)間依賴性。BmKr-h1位于JH受體BmMet2的下游響應(yīng)JH的誘導(dǎo)表達(dá)，而且過(guò)表達(dá)BmKr-h1后Bmdimm的表達(dá)量提高而蛻皮激素初級(jí)反應(yīng)基因Brc-Z2和Brc-Z4的表達(dá)受到抑制，表明在家蠶細(xì)胞系中存在激素信