水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY13的功能鑒定和調(diào)控機理研究.pdf

1、在植物的抗病反應中，信號分子水楊酸和茉莉酸介導著兩個截然不同的抗病信號途徑，而且通常認為這兩個途徑存在一定程度的拮抗。大量的研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族在上述植物抗病反應中扮演著重要的角色。白葉枯病和稻瘟病是影響水稻生產(chǎn)的兩個重要病害，盡管目前在水稻基因組中已經(jīng)鑒定了109-112個WRKY基因，但是關于此家族成員在水稻抗病反應中的作用仍然不是很清楚，特別是關于WRKY因子在抗病信號傳導途徑中的地位。本研究

2、通過運用各種功能基因組學的研究手段，研究了一個受病原誘導的水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY13在水稻抗病反應中的主要功能。 利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化在感病品種牡丹江8中超量表達OsWRK13，共分離檢測結果表明，無論是苗期還是成株期都增強了轉(zhuǎn)基因植株對白葉枯病和稻瘟病的抗性；相反的是，反義抑制的明恢63轉(zhuǎn)化植株也表現(xiàn)了對白葉枯病感病性的提高。采用定量RT-PCR的方法進一步檢測了上述轉(zhuǎn)基因植株中病程相關蛋白和其它與水楊酸及茉莉酸

3、代謝相關的基因的表達情況。在接種前后的至少在一個檢測時間點OsWRK13超量表達植株中比對照牡丹江8聚集了更多的PRla基因的轉(zhuǎn)錄本，而且反義表達植株中互補了這種表達模式；同時，PR10和JIOsPR10基因的表達量在OsWRKY13超量表達植株中比對照牡丹江8的明顯要低；而對11個與水楊酸、茉莉酸或者環(huán)氧脂類信號傳導途徑相關基因的表達分析顯示，OsWRKY13的表達量提高至少在一個時間點顯著地誘導了基因CHS，PAD4和ICS1的表達

4、，但是部分抑制基因OsWRKY13的表達量對這3個基因的表達沒有影響；同時，超量表達OsWRK13則顯著抑制了基因AOS2和POX的表達，而且抑制OsWRKY13顯著提高了這兩個基因的表達。利用酵母單雜交實驗證明了OsWRKY13對PRla，AOSl，AOS2和LOX的啟動子具有很強轉(zhuǎn)錄激活能力，而對ICSl，NH.，和PAD4則沒有；同時利用超量表達植株的核蛋白和重組蛋白OsWRKY13-GST進行的體外DNA結合和蛋白質(zhì)磷酸化實驗進

5、一步表明，OsWRKY13能特異的結合到W-盒或者類W-盒上，而且這種結合受到病原物侵染的調(diào)控影響，推測這種影響部分來自對蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)產(chǎn)生的改變。結合超量表達植株中水楊酸含量提高和茉莉酸含量下降的結果，我們認為OsWRKY13通過激活水楊酸信號途徑和抑制茉莉酸信號傳導途徑，參與水稻的抗病反應。 為了進一步分析OsWRKY13所調(diào)控的下游基因以及其調(diào)控方式，本研究對超量表達植株芯片分析中所獲得的差異表達基因進行了深入的分析。首

6、先，差異表達基因的Geneontology(GO)分類顯示OsWRKY13正調(diào)控類黃酮代謝，負調(diào)控萜類和脂類代謝過程，而上述過程正好分別與水楊酸和茉莉酸的代謝途徑相關；其次，進一步統(tǒng)計分析了差異表達基因啟動子區(qū)保守順式元件，并通過采用窮舉法的方法掃描了差異表達基因啟動子區(qū)域的保守模體，結果發(fā)現(xiàn)在上升表達的基因中顯著富集了W-盒(GTTGACC)，而在下降的基因中富集了MYB轉(zhuǎn)錄因子的結合位點，同時GCC-盒在下降基因的啟動子區(qū)域中呈明顯

7、的減少趨勢，并且這種順式調(diào)控元件的變化正好與差異表達的轉(zhuǎn)錄因子相吻合。因此，推測OsWRKY13很可能協(xié)同MYB和AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因，影響類黃酮代謝和脂類代謝過程。此外，本研究還分析了OsWRKY13與其它水稻W(wǎng)RKY家族成員的關系以及與擬南芥AtWRKY70共調(diào)控的基因。結果表明，OsWRKY13超量表達后負調(diào)控許多水稻W(wǎng)RKY基因，特別是與ABA信號相關的；同時在擬南芥AtWRKY70與OsWRKY13參與的抗病反應