piggyBac轉(zhuǎn)座子亞末端對(duì)轉(zhuǎn)座活性的影響.pdf

1、piggyBac轉(zhuǎn)座子屬于DNA型轉(zhuǎn)座子，具有插入并且精確切離靶位點(diǎn)特性，是目前轉(zhuǎn)基因研究中應(yīng)用最廣泛的工具之一，目前對(duì)于piggyBac類轉(zhuǎn)座子的研究主要集中在不同生物體中新型轉(zhuǎn)座子及其應(yīng)用范圍的探索，而對(duì)于轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系的研究卻較少。本文試圖在不同細(xì)胞寄主與活體寄主中利用不同組合重組載體探索亞末端對(duì)piggyBac轉(zhuǎn)座活性的影響，現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)如下:
　　1、以來自棉鈴蟲HaPLE和來自銀紋夜蛾AaPLE的轉(zhuǎn)座酶，構(gòu)建了H

2、elper輔助質(zhì)粒，并利用二元轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，在果蠅S2細(xì)胞中檢測(cè)了這兩種轉(zhuǎn)座酶對(duì)不同末端重復(fù)序列和亞末端重復(fù)序列組合的重組供體質(zhì)粒的剪切活性。結(jié)果顯示，AaPLE轉(zhuǎn)座酶不具備活性，但HaPLE可以識(shí)別自身末端反向重復(fù)序列與赤擬谷盜亞末端反向重復(fù)序列組合的重組供體，這表明HaPLE轉(zhuǎn)座酶具有明顯的轉(zhuǎn)座活性，它可以識(shí)別自身末端反向重復(fù)序列與適宜亞末端反向重復(fù)序列構(gòu)建的供體質(zhì)粒，但剪切的精確性可能受到亞末端的影響。
　　2、通過不同亞末端替

3、換構(gòu)建供體，在果蠅S2細(xì)胞中檢測(cè)了小地老虎AyPLE和棉蚜AgPLE的轉(zhuǎn)座酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AyPLE、AgPLE對(duì)所試供體質(zhì)粒均有顯著的剪切活性，不同亞末端對(duì)轉(zhuǎn)座活性有一定影響，但統(tǒng)計(jì)差異不顯著。這揭示了轉(zhuǎn)座酶可能存在適應(yīng)不同亞末端的自身調(diào)控機(jī)制。此外，也可能是由于所選亞末端種類較少，未能檢測(cè)出亞末端的顯著影響。
　　3、利用Helper/Donor二元轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在倉鼠腎上皮細(xì)胞BHK中檢測(cè)了來自粉紋夜蛾IFP2、小地老虎AyPLE

4、和棉蚜AgPLE轉(zhuǎn)座酶對(duì)不同亞末端供體的剪切活性。結(jié)果顯示，在BHK細(xì)胞中AyPLE轉(zhuǎn)座酶可以識(shí)別剪切來自小地老虎末端反向重復(fù)序列與紅鈴蟲亞末端反向重復(fù)序列組合的重組供體Ay-Pg，AgPLE轉(zhuǎn)座酶與來自棉蚜末端反向重復(fù)序列與赤擬谷盜亞末端反向重復(fù)序列組合的重組供體Ag-Tc，以及來自棉蚜末端反向重復(fù)序列與粉紋夜蛾亞末端反向重復(fù)序列組合的重組供體Ag-d共轉(zhuǎn)染均能產(chǎn)生近似精確剪切條帶。綜合在果蠅S2細(xì)胞的分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)座酶剪切精確性受

5、寄主細(xì)胞和亞末端反向重復(fù)序列共同影響。
　　4、利用Helper/Donor二元轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在和顯微注射技術(shù)在不同昆蟲中檢測(cè)IFP2、AyPLE和AgPLE轉(zhuǎn)座酶對(duì)不同亞末端重組供體剪切活性。結(jié)果顯示:研究同綱同目不同種宿主亞末端是否會(huì)影響轉(zhuǎn)座子對(duì)不同重組供體精確剪切活性。結(jié)果顯示:IFP2轉(zhuǎn)座子在實(shí)驗(yàn)所選取的這幾類昆蟲中都具有精確剪切活性，AyPLE、AgPLE轉(zhuǎn)座子在不同昆蟲都只能產(chǎn)生非精確剪切，這可能和AyPLE、AgPLE轉(zhuǎn)座