綿羊Gfra1基因的克隆和多克隆抗體的制備及應(yīng)用.pdf

1、精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells，SSCs)表面標(biāo)記基因遺傳信息及其產(chǎn)物蛋白的抗體在精原干細(xì)胞研究中占有舉足輕重的地位。表面標(biāo)記基因的cDNA序列可用于SSCs的轉(zhuǎn)錄表達(dá)鑒定，其翻譯產(chǎn)物表面標(biāo)記抗體可用于流式細(xì)胞儀分離純化SSCs，或者用于SSCs的免疫熒光染色鑒定。大動物SSCs的長期純化培養(yǎng)至今沒有成功的報道，跟SSCs表面標(biāo)記分子的DNA序列及抗體的缺乏有一定的關(guān)系。GFRα1是SSCs細(xì)胞膜上的GD

2、NF受體蛋白，也是精原干細(xì)胞(SSCs)的表面標(biāo)記基因之一，在調(diào)節(jié)SSCs的增殖和分化過程中扮演著重要的角色。GDNF通過SSCs膜表面的GFRα1受體介導(dǎo)與RET蛋白結(jié)合，引起RET二聚化及酪氨酸殘基位點發(fā)生自磷酸化啟動下游信號通路，促進SSCs的自我更新。至今為止，綿羊的Gfrα1基因序列還沒有報道，影響了綿羊SSCs的深入研究。所以有必要對綿羊Gfrα1基因進行研究，為綿羊精子發(fā)生過程的研究和精原干細(xì)胞的分離純化培養(yǎng)鑒定奠定基礎(chǔ)。

3、
　　 1、綿羊Gfrα1基因的克隆
　　 比較公布的人、大鼠、小鼠、牛、黑猩猩的Gfrα1基因的核苷酸序列，找到保守區(qū)設(shè)計PCR引物，以綿羊睪丸組織cDNA為模板，用RT-PCR法擴增得到約1041bp的綿羊Gfrα1基因中段片段，將擴增的產(chǎn)物連接到pMD-19T載體上然后測序。根據(jù)Gfrα1cDNA編碼區(qū)的中段和牛的Gfrα1基因序列再設(shè)計一對引物用于克隆Gfrα1cDNA編碼區(qū)的前段。將Gfrα1基因編碼區(qū)的前段和

4、中段的測序結(jié)果通過軟件拼接?？寺〉玫降木d羊Gfrα1基因的大部分cDNA序列包括起始密碼子在內(nèi)共1312bp，包括1311bp的開放閱讀框(ORF)，編碼437個氨基酸，與牛、人、黑猩猩、大鼠和小鼠相應(yīng)核苷酸序列的同源性分別為98.5％、91.3％、91.0％、88.9％和88.0％。這說明進化過程中Gfrα1基因序列具有高度保守性，而綿羊作為反芻動物在Gfrα1基因序列上具有種屬特異性。
　　 2、構(gòu)建原核表達(dá)載體及抗原表位多

5、肽的制備與純化
　　 根據(jù)測得的cDNA序列，用軟件預(yù)測已知片段的抗原表位區(qū)。采用PCR方法擴增得到Gfrα1抗原表位DNA片段。將抗原表位片段插入pET-44a(+)表達(dá)載體，獲得重組質(zhì)粒pET-44a-Gfra1，Gfrα1抗原表位DNA片段與表達(dá)載體的his-tag連接，形成his-Gfra1融合多肽表達(dá)框。pET-44a-Gfra1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化得到pET-44a-Gfra1重組菌。分析重組菌表達(dá)his-Gfra1多肽的最

6、佳條件為用1mMIPTG誘導(dǎo)8小時。經(jīng)過擴大培養(yǎng)重組菌，收取菌體制備細(xì)胞裂解液，并通過Ni-NTA柱層析，純化制備his-Gfrα1融合多肽。經(jīng)Westernblot鑒定，his-Gfrα1融合多肽分子量約為18.2KD，與預(yù)測的大小一致。本研究成功地在大腸桿菌中實現(xiàn)了綿羊Gfrα1基因抗原表位多肽的表達(dá)，并且獲得了純化的Gfrα1基因抗原表位多肽，為下一步制備多克隆抗體打好了基礎(chǔ)。
　　 3、用S180腹水瘤細(xì)胞刺激產(chǎn)生多克隆

7、抗體及多克隆抗體的鑒定
　　 將純化的his-Gfra1抗原表位多肽免疫6-8周的C57小鼠，共免疫5次，每次間隔12天。末次免疫后一周，小鼠腹腔注射S180細(xì)胞，刺激產(chǎn)生腹水制備Gfrα1的多克隆抗體，待小鼠腹部增大收集腹水獲得Gfrα1多克隆抗體。經(jīng)間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測，證明本實驗制備的多克隆抗體效價為1∶800，具有較高的特異性，綿羊睪丸組織GFRα1蛋白免疫印跡分析實驗(westernblotting)

8、檢測結(jié)果顯示，在50KD左右有特異性條帶產(chǎn)生，這與預(yù)測的GFRα1蛋白的大小一致，說明制備的抗體確實能和綿羊睪丸組織全蛋白中的GFRα1蛋白結(jié)合。證明本實驗制備的多克隆抗體具有較高的特異性。
　　 4、應(yīng)用綿羊GFRα1多克隆抗體鑒定體外培養(yǎng)的綿羊SSCs
　　 對本實驗室體外長期培養(yǎng)的綿羊SSCs細(xì)胞進行GFRα1和PLZF雙免疫熒光染色，所使用的抗體為本實驗制備的GFRα1抗體和市售的PLZF抗體。前人研究報道已證實

9、PLZF是綿羊SSCs特異的標(biāo)記分子。用PLZF抗體對長期培養(yǎng)的SSCs進行免疫熒光染色，SSCs顯示陽性，而滋養(yǎng)層細(xì)胞呈陰性，證明本實驗室得到了長期培養(yǎng)的綿羊SSCs。用本室自制的GFRα1抗體與PLZF抗體對長期培養(yǎng)的綿羊精原干細(xì)胞進行免疫熒光雙標(biāo)染色，結(jié)果顯示這兩種抗體免疫熒光染色的細(xì)胞完全重疊。上述結(jié)果例證了本實驗室自制的GFRα1抗體能夠作為綿羊SSCs的標(biāo)記分子，用于綿羊SSCs的鑒定分析。本研究結(jié)果為開展綿羊SSCs的研究