油菜(Brassica napus)miRNA的鑒定及Bna-miR1140表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、miRNAs(microRNA)是一類在進(jìn)化上保守的長(zhǎng)約21nt的非編碼單鏈RNA,在基因表達(dá)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置,高效的調(diào)控其靶基因的翻譯或表達(dá),在生物體生長(zhǎng)發(fā)育、抵抗生物或者非生物脅迫以及在生物體代謝途徑中起著非常重要的作用。在短短的10年時(shí)間內(nèi),植物miRNAs的研究取得了突飛猛進(jìn)的成果,成為一個(gè)新的研究領(lǐng)域。油菜(rapeorrapeseed)作為世界性的重要油料作物,研究其miRNA所參與的遺傳控制機(jī)理,對(duì)于培育理想油菜品

2、種,增加油菜產(chǎn)量和降低油菜生產(chǎn)成本具有重要意義。
　　鑒于目前對(duì)油菜miRNAs及其靶基因的研究報(bào)道還很少,且sanger數(shù)據(jù)庫(kù)中可參考的miRNAs信息也僅僅48條,本研究對(duì)甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)栽培種Westar材料進(jìn)行小RNA測(cè)序及降解組分析,鑒定新的油菜miRNAs,尋找已知miRNAs和新發(fā)現(xiàn)的miRNAs的靶基因,并對(duì)蕓薹屬獨(dú)特的miRNA家族Bna-miR1140進(jìn)行表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究,以期為油菜品種

3、改良和油菜miRNAs調(diào)控機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。
　　主要結(jié)果如下:
　　1.鑒定獲得了41個(gè)新的保守油菜miRNAs以及67個(gè)蕓薹屬特有的新候選miRNAs,其中包括20個(gè)miRNAs*序列。利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證了測(cè)序結(jié)果。并將新發(fā)現(xiàn)的miRNAs提交miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)。
　　2.依據(jù)NCBI中現(xiàn)有的油菜EST和基因組數(shù)據(jù),利用targetfinder軟件預(yù)測(cè)了油菜miRNAs靶基因,分別獲得保守

4、的miRNAs和特異的新候選miRNAs靶向的基因113個(gè)和84個(gè)。其中Bna-miR1140的潛在靶基因?yàn)橐环N糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase)和響應(yīng)調(diào)節(jié)因子(ArabidopsisresponseregulatorARR8-likeprotein)。
　　3.克隆得到了油菜Bna-miR1140基因前體197bp的片段,構(gòu)建了植物過(guò)表達(dá)載體35S::Bna-miR1140,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法浸染油菜子葉柄轉(zhuǎn)化甘

5、藍(lán)型油菜栽培種Westar。獲得了14個(gè)PCR陽(yáng)性植株,其中有5株株型特異,表現(xiàn)雙主序表型,分枝數(shù)明顯增多,其他9株陽(yáng)性株均與野生型油菜表型一致,推測(cè)可能與表達(dá)強(qiáng)度有關(guān)。調(diào)查了株型特異的5個(gè)株系T1代表型分離情況,經(jīng)卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中有4個(gè)株系的株型變異遺傳符合3:1的孟德爾分離規(guī)律。初步推測(cè)油菜Bna-miR1140可能參與調(diào)控了油菜的分枝發(fā)育。
　　4.分離得到了油菜Bna-miR1140基因上游1351bp的序列,利用plan

6、tCARE在線軟件對(duì)啟動(dòng)子序列的順式作用元件進(jìn)行在線分析,該啟動(dòng)子含有與轉(zhuǎn)錄必需的RNA聚合酶結(jié)合的TATA盒以及在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄效率中發(fā)揮重要作用的CAAT盒,并進(jìn)一步構(gòu)建了miR1140pro::GUS植物表達(dá)載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化油菜,得到5株P(guān)CR陽(yáng)性植株,對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的根、莖、葉、葉腋(莖尖分生組織,SAM)、葉柄、花、種莢等組織和器官進(jìn)行GUS染色分析,結(jié)果表明GUS僅在葉柄及葉腋中表達(dá),這與Bna-miR1140體內(nèi)表達(dá)