腎缺血再灌注損傷中miRNA表達(dá)譜篩選及mir-98調(diào)控HUVEC凋亡的作用.pdf

1、第一部分、大鼠腎臟缺血再灌注損傷時(shí)miRNA表達(dá)譜的篩查
　　目的：通過基因芯片篩選大鼠腎臟缺血再灌注損傷后miRNAs表達(dá)譜的變化并分析。
　　方法：
　　1、構(gòu)建SD大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型:大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，禁食約12h，腹腔麻醉并消毒后，經(jīng)腹正中線切開皮膚、腹膜，充分暴露雙側(cè)腎蒂，使用無創(chuàng)微型血管夾迅速夾閉雙側(cè)腎蒂，傷口覆蓋鹽水紗布，恒溫?zé)舯３指共矿w溫，45min后同時(shí)松開血管夾，縫合腹膜和皮膚。大鼠造

2、模12h后，再次麻醉大鼠，收集標(biāo)本。
　　2、實(shí)驗(yàn)分組:10周齡大鼠12只隨機(jī)分為兩組，每組6只:①實(shí)驗(yàn)組:雙側(cè)腎臟血管夾夾閉45分鐘后再灌注12小時(shí)后收集標(biāo)本;②假手術(shù)組:同樣的方法游離暴露雙側(cè)腎蒂，直接覆蓋鹽水紗布后等待45min，12h后逐層縫合切口。
　　3、標(biāo)本收集和檢測方法:心臟穿刺取血，檢測血清肌酐與尿素氮，同時(shí)取腎臟利用microRNA芯片技術(shù)檢測腎臟缺血再灌注時(shí)miRNA的表達(dá)變化，最后通過RT-PCR驗(yàn)證

3、芯片檢測結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　1、成功構(gòu)建大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型，缺血再灌注損傷后血清肌酐和尿素氮水平明顯升高。
　　2、通過microRNAs芯片結(jié)果觀察到大鼠腎臟缺血再灌注損傷后36條miRNAs出現(xiàn)明顯的表達(dá)變化，其中有15條miRNAs表達(dá)差異超過兩倍。通過RT-PCR驗(yàn)證與miRNAs芯片結(jié)果一致，其中10條miRNAs表達(dá)上調(diào)，5條miRNA表達(dá)下調(diào)，表達(dá)上調(diào)的分別是:miR-98、miR-196a、

4、miR-146b、miR-292-5p、miR-132、miR-327、miR-374、miR-290、miR-352、和miR-894，下調(diào)的miRNA是:miR-145、miR-29a、miR-329、miR-140和miR-375。
　　結(jié)論
　　大鼠腎臟缺血再灌注損傷時(shí)miRNA表達(dá)譜發(fā)生明顯變化，可能通過炎癥激活、細(xì)胞凋亡與增殖、血管形成和間質(zhì)纖維化等參與腎臟缺血再灌注損傷的發(fā)生與發(fā)展，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

5、
　　第二部分、缺氧復(fù)氧損傷時(shí)HUVEC中miR-98的表達(dá)變化及其通過靶基因Caspase-3對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控
　　目的：體外探討微血管內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧復(fù)氧損傷后miR-98表達(dá)水平的變化及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，并探討可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1、培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)，構(gòu)建體外的缺氧復(fù)氧模型，通過輕質(zhì)石蠟油覆蓋細(xì)胞表面模擬

6、缺血刺激。60min后，加入無血清無糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，用RT-PCR法檢測檢測miR-98的表達(dá)。
　　2、HUVEC轉(zhuǎn)染miR-98 inhibitor和Mimics及相應(yīng)的對(duì)照，抑制或過表達(dá)miRNA;在缺氧復(fù)氧模型，在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測潛在靶基因caspase-3的表達(dá)變化，流式細(xì)胞儀和TUNEL檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　3、通過生物信息學(xué)檢索，明確miR-98和caspase-

7、3的3'端UTR區(qū)的堿基互補(bǔ)序列。并構(gòu)建3UTR(Casp3)報(bào)告基因載體和3UTR(Casp3) mut報(bào)告基因載體。目的基因3'UTR區(qū)域構(gòu)建至載體中報(bào)告基因螢光素酶的后面，通過比較過表達(dá)miRNA后，報(bào)告基因表達(dá)的改變定量反映miRNA對(duì)目的基因的抑制作用。
　　結(jié)果：
　　1、HUVEC缺氧復(fù)氧后miR-98表達(dá)4h即出現(xiàn)上升;24h時(shí)表達(dá)升至對(duì)照組5倍。
　　2、體外轉(zhuǎn)染miR-98 inhibitor后，發(fā)

8、現(xiàn)Caspase-3與miR-98之間存在明顯的負(fù)相關(guān)現(xiàn)象。
　　3、成功構(gòu)建3UTR(Casp3)報(bào)告基因載體和3UTR(Casp3) mut報(bào)告基因載體（突變模式為CTACCTCA突變?yōu)锳ACAUCGA; miR-98可調(diào)節(jié)CASP33'UTR的 luciferase的表達(dá)(p＜0.0001)。
　　結(jié)論：
　　1、HUVEC缺氧復(fù)氧損傷后出現(xiàn)miR-98的表達(dá)上升。
　　2、miR-98的表達(dá)對(duì)IRI損傷后