胃遠(yuǎn)端腺癌miRNA表達(dá)譜及miR-204調(diào)控機(jī)制的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　 微小RNAs（micro RNAs，miRNAs）是一類長約21～25 m的非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于動植物中。它通過與靶mRNA完全或不完全的互補配對，產(chǎn)生基因沉默、發(fā)揮負(fù)性調(diào)控基因表達(dá)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，特定的miRNA在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、基因調(diào)控及腫瘤的發(fā)生中扮演重要的角色。其在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起癌基因或者抑癌基因的作用，為胃癌的診斷、治療和預(yù)后評估提供了新的工具。但迄今為止，真正確認(rèn)功能的mi

2、RNA還微乎其微，而且其發(fā)揮作用的具體機(jī)制也有待進(jìn)一步的研究以明確。已有報道，與胃遠(yuǎn)端腺癌相比，賁門腺癌不僅位置獨特，發(fā)病機(jī)制也存在不同。
　　 目的：
　　 篩選胃遠(yuǎn)端腺癌中差異表達(dá)的miRNAs，觀察其與臨床病理因素的關(guān)系，并就其在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機(jī)制進(jìn)行初步的研究。
　　 方法：
　　 1.取我科實驗室液氮凍存的胃遠(yuǎn)端腺癌及配對正常組織進(jìn)行HE染色，確認(rèn)病理情況；采用Aglent人miRN

3、A寡核苷酸基因芯片，對3對胃遠(yuǎn)端（體、竇）腺癌組織及配對正常組織進(jìn)行檢測，篩選胃遠(yuǎn)端腺癌差異表達(dá)的miRNAs。
　　 2.選擇特定miRNAs，在20例胃遠(yuǎn)端腺癌及配對正常組織中用實時熒光定量PCR進(jìn)行驗證，并觀察其與患者年齡、腫瘤大小、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素的關(guān)系；在得到確認(rèn)差異表達(dá)的miRNAs后，同法觀察其在17例賁門腺癌與胃遠(yuǎn)端腺癌之間表達(dá)是否存在差異、胃腺癌患者血清中的表達(dá)狀況、人胃粘膜細(xì)胞系與人胃癌細(xì)胞系的

4、表達(dá)狀況。
　　 3.選擇特定miRNA轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞系，運用MTS法、流式細(xì)胞術(shù)觀察其對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。
　　 4.運用TargetScan等生物信息學(xué)方法，預(yù)測特定miRNA可能的靶基因。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過對液氮凍存胃遠(yuǎn)端腺癌及配對正常組織的HE染色，確認(rèn)了各自的病理狀況；miRNAs芯片檢測，發(fā)現(xiàn)共47條miRNAs在胃遠(yuǎn)端腺癌組織和配對正常組織中表達(dá)差異顯著，上調(diào)的24條，下

5、調(diào)的23條；在這些差異表達(dá)的miRNAs中，miR-204、miR-196b、miR-101、miR-107等27條首次報道于胃遠(yuǎn)端腺癌中；
　　 2.選擇3個高表達(dá)miRNAs：miR-18b、miR-93、miR-196b和2個低表達(dá)的miRNAs：miR-204、miR-375進(jìn)行實時熒光定量PCR分析，顯示在胃遠(yuǎn)端腺癌患者樣本中，miR-196b、miR-204、miR-375的表達(dá)情況與芯片一致，但其與患者年齡、癌栓有

6、無、腫瘤直徑，分化程度、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均沒有關(guān)聯(lián)；同時，miR-204水平在胃腺癌患者血清中顯著升高，ROC曲線分析顯示，血清miR-204水平對胃腺癌患者和健康對照的鑒別效能為0.844（95％CI：0.579-0.973，p=0.002），敏感性和特異性分別為100％和75％，最佳cut-off值為0.0343（2-△Ct，相對于U6 snRNA）；在賁門腺癌和胃遠(yuǎn)端腺癌中，miR-375表達(dá)均下調(diào)，而胃遠(yuǎn)端腺癌下調(diào)的更明顯，

7、兩者有顯著性差異。
　　 3.轉(zhuǎn)染成熟miR-204 mimics于人胃癌細(xì)胞系MGC-803、BGC-823、SGC-7901，發(fā)現(xiàn)不論是不同轉(zhuǎn)染濃度，抑或是不同時間點，對腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡沒有明顯的影響。
　　 4.生物信息學(xué)顯示BCL-2，NR3C1，SOCS6等可能為miR-204的靶基因。
　　 結(jié)論：
　　 1.胃遠(yuǎn)端腺癌有其獨特的miRNA表達(dá)譜；
　　 2.驗證的差異表達(dá)miRN