調(diào)節(jié)NMD通路中SMG5的miR-433的鑒定及miRNA-NMD-作用底物調(diào)控通路的初步研究.pdf

1、在真核細(xì)胞的進(jìn)化過程中形成許多mRNA質(zhì)量監(jiān)控機(jī)制來實(shí)現(xiàn)基因的準(zhǔn)確表達(dá)，其中無義介導(dǎo)的mRNA降解（nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD）是一種重要的轉(zhuǎn)錄后監(jiān)控機(jī)制，可識(shí)別含提前終止密碼子（prematureterminationcodons，PTC）的異常mRNA并對(duì)其進(jìn)行降解，有效避免產(chǎn)生的截短蛋白對(duì)細(xì)胞的毒害。其中，SMG5在NMD中扮演著重要的角色，SMG5是一個(gè)編碼蛋白基因，沒有核糖核酸酶活性，但對(duì)逆轉(zhuǎn)

2、錄酶的活性有促進(jìn)作用，它和SMG7一起被認(rèn)為與涉及核酸外切途徑的mRNA降解機(jī)制存在聯(lián)系—通過招募磷酸酯酶2A(PP2A)引起UPF1的脫磷酸化。
　　microRNA(miRNA)是一類長度約為19-24nt內(nèi)源性保守單鏈非編碼小分子RNA。miRNA通過與靶基因mRNA的3'UTR特異互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)靶mRNA的表達(dá)或者阻止蛋白的翻譯，目前研究表明，miRNA參與了許多生理及病理的過程，例如，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展和

3、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和分化的生物化學(xué)過程等。但是目前有關(guān)miRNA參與NMD通路的報(bào)道比較少，因此，作用于NMD通路中的主要因子的miRNAs是不是介導(dǎo)mRNA的降解是一個(gè)值得研究的課題，本試驗(yàn)以NMD通路中的關(guān)鍵因子SMG5為研究對(duì)象，通過生物信息學(xué)的方法篩選出潛在的以SMG5為靶基因的miR-433。并利用分子生物學(xué)方法研究二者的作用關(guān)系，以及在NMD通路中所發(fā)揮的作用。主要的研究結(jié)果如下:
　　(1)生物信息學(xué)預(yù)測潛在調(diào)

4、控SMG5的miRNAs。利用生物信息學(xué)軟件TargetScan等對(duì)作用于SMG53'UTR的miRNA進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果得到了多個(gè)miRNAs，經(jīng)過篩選最終確定miR-433作為研究對(duì)象。
　　(2)組織表達(dá)譜的構(gòu)建。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測miR-433和SMG5在小鼠心、肝、腎等十二種組織的表達(dá)量，并繪制了組織表達(dá)譜。結(jié)果顯示:SMG5基因在小鼠組織中廣泛表達(dá)，miR-433在腦和肌肉中表達(dá)量較高。
　　(3)雙熒光素酶

5、報(bào)告基因的檢測。根據(jù)miR-433與SMG5基因的3'UTR結(jié)合序列，構(gòu)建了野生型和突變型熒光素酶報(bào)告基因pmirGLO載體。并將這兩種質(zhì)粒分別與miR-433mimic和miR-433inhibitor共轉(zhuǎn)入HEK-293T細(xì)胞、Hela細(xì)胞，檢測相應(yīng)的熒光活性，結(jié)果表明:miR-433與SMG5之間存在負(fù)調(diào)控的關(guān)系。
　　(4)miR-433調(diào)控SMG5的表達(dá)檢測。miR-433mimic轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞后，利用RT-PCR和W

6、esternblot檢測SMG5的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn):SMG5的mRNA表達(dá)量顯著下降(P＜0.01)，miR-433也降低了SMG5蛋白水平;而將miR-433inhibitor轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞后，得到的結(jié)果剛好相反，SMG5的表達(dá)量顯著上升(P＜0.01)，miR-433inhibitor上調(diào)了SMG5的蛋白水平。
　　(5)利用熒光定量PCR和westernbolt檢測miR-433調(diào)控SMG5底物基因GADD45B、TBL

7、2的表達(dá)。將miR-433mimic轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，利用熒光定量PCR和westernbolt檢測NMD中SMG5底物基因TBL2、GADD45B的表達(dá)，結(jié)果顯示:miR-433上調(diào)了TBL2、GADD45B的表達(dá)，進(jìn)一步推斷miR-433參與NMD通路。
　　(6)干擾SMG5對(duì)底物基因的影響。利用SMG5基因的siRNA，轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測SMG5被干擾后底物基因TBL2、GADD45B的表達(dá)量，結(jié)果顯示: