廣西馬源H9N2亞型流感病毒的分離鑒定與全基因組序列分析.pdf

1、本研究采用RT-PCR和血清學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)從廣西4個(gè)市采集的馬肺組織樣品和馬血清進(jìn)行H9N2亞型流感病毒的檢測(cè)，從284份馬肺組織樣品接種雞胚后收取的尿囊液中，檢測(cè)出1份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為0.35％；而檢測(cè)的1110份馬血清，H9N2亞型陽(yáng)性有7份，陽(yáng)性率為0.54％。應(yīng)用雞胚接種的方法分離出一株病毒，通過(guò)血凝抑制實(shí)驗(yàn)及對(duì)8個(gè)片段的全基因克隆及序列分析，鑒定為H9N2亞型流感病毒，將分離株命名為A/equine/Guangxi/3/201

2、1(H9N2)(簡(jiǎn)稱(chēng)GX3株)。對(duì)GX3株進(jìn)行雞胚半數(shù)致死量(ELD50)和1日齡雛雞腦內(nèi)接種指數(shù)(ICPI)測(cè)定試驗(yàn)，其ELD50和ICPI值分別為10-6.43/0.2mL和0.09；經(jīng)免疫效果試驗(yàn)證明GX3株具有較好的免疫原性；對(duì)GX3株各基因的關(guān)鍵位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，GX3株HA基因的氨基酸在第183、225、227及228位點(diǎn)處均非常保守，而在226位氨基酸為亮氨酸(Leu)，具有受體SAα-2，6-Gal特異性；在HA裂解位點(diǎn)處含

3、有2個(gè)堿性氨基酸，其HA1與HA2氨基酸裂解位點(diǎn)處的序列為RSSRGLF，具有典型的低致病性流感病毒裂解位點(diǎn)的氨基酸序列特征；PB2基因第627、701、714位氨基酸分別為谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、絲氨酸(Ser)，PB1-F2蛋白的第66位氨基酸為天冬酰胺(Asn)，NP基因第319位氨基酸為天冬酰胺(Asn)，NS1蛋白的第92位氨基酸為天冬氨酸(Asp)，這些都說(shuō)明GX3株為低致病性毒株。糖基化位點(diǎn)分析中，HA和NA

4、基因均具有8個(gè)糖基化位點(diǎn)，其中HA在第313位氨基酸處比參考毒株多出一個(gè)糖基化位點(diǎn)，NA在第44位氨基酸位點(diǎn)處比參考毒株多出一個(gè)糖基化位點(diǎn)，而其余的糖基化位點(diǎn)均比較保守，沒(méi)有出現(xiàn)明顯改變。耐藥性基因位點(diǎn)分析中，NA基因119E、151D、276E、292R、294N，表明GX3株對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制類(lèi)藥物敏感；M2基因S31N，表明GX3株具有金剛烷胺類(lèi)藥物的抗性。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及核苷酸同源性分析可知GX3株各個(gè)基因片段的大體來(lái)源：PB2和