華南地區(qū)小種群禽類(lèi)中H9N2亞型流感病毒特性研究.pdf

1、流行性感冒(簡(jiǎn)稱(chēng),流感)是由不斷變異的流感病毒(RNA病毒)引起的一種傳染性疾病。其快速的抗原性變異能夠逃避人群中的免疫監(jiān)控而造成流行,這要求我們必須對(duì)其流行進(jìn)行連續(xù)的監(jiān)測(cè),以達(dá)到不斷更新疫苗預(yù)防流感的目的。研究表明,哺乳類(lèi)動(dòng)物,包括人類(lèi),的流感病毒都直接或間接來(lái)源于禽類(lèi)流感病毒。目前H9N2亞型流感病毒分布廣泛,多次發(fā)生傳染人的事件,加上華南地區(qū)作為理論中“流感中心”的特殊地位,因此對(duì)該地區(qū)進(jìn)行嚴(yán)密的流感病毒監(jiān)測(cè)具有重要的意義,特別是

2、對(duì)近年來(lái)該地區(qū)不斷涌現(xiàn)的新種群中流感病毒進(jìn)行檢測(cè)。本研究以鷓鴣/歐石鳥(niǎo)(Pa/Cu)中H9N2亞型流感病毒為對(duì)象,對(duì)其進(jìn)行全面的分子流行病學(xué)分析。結(jié)果表明,H9N2亞型流感病毒在這些新種群中廣泛流行,并且檢測(cè)到多個(gè)基因型的存在,進(jìn)化樹(shù)分析證實(shí)有多個(gè)基因型與同期在水禽類(lèi)中分離到的基因型相近:這表明H9N2亞型流感病毒很可能通過(guò)發(fā)生跨種屬傳遞從水禽感染這些小種群陸基禽類(lèi)。作為大流感預(yù)防的一部分,對(duì)這些新形成小種群中的H9N2亞型流感病毒進(jìn)行

3、進(jìn)一步的監(jiān)測(cè)和研究顯得尤為迫切。
　　背景和目的:
　　近年來(lái),在素有“世界流感流行中心”之稱(chēng)的華南地區(qū)禽流感頻繁暴發(fā),這給人們帶來(lái)了嚴(yán)重的財(cái)產(chǎn)和健康損失。尤其是H9N2亞型流感病毒,其活動(dòng)十分猖獗。流行病學(xué)和遺傳學(xué)研究表明,該亞型的流感病毒具有廣泛的地理和宿主分布,而且在人群中有較高的隱性感染率。最近在香港和廣東地區(qū)的人群中又相繼分離到H9N2亞型流感病毒,表明H9N2亞型流感病毒很可能成為誘發(fā)下次人類(lèi)大流感的病毒株。因此

4、我們必須對(duì)該亞型的流感病毒進(jìn)行嚴(yán)密的監(jiān)測(cè),為可能的大流感暴發(fā)做準(zhǔn)備。華南地區(qū)近年來(lái)的工業(yè)化進(jìn)程加快,野鳥(niǎo)家養(yǎng)化導(dǎo)致許多新種群的形成和流感病毒生態(tài)系統(tǒng)的改變。在這些新形成的流感病毒易感種群中, H9N2亞型的流行情況至今未有研究。本課題意在:
　　1、以Pa和Cu為代表,探討H9N2亞型流感病毒在這些新形成的小種群中的流行情況;
　　2、探討這些小種群中流感病毒的來(lái)源:是從其它動(dòng)物跨種屬傳遞而來(lái),還是本身為流感病毒的天然宿主;

5、
　　3、探討這些新形成種群中H9N2亞型流感病毒的進(jìn)化情況,以及其在整個(gè)流感病毒生態(tài)體系中的作用;
　　材料和方法:
　　每周采集標(biāo)本一次,常規(guī)處理后,接種于9-11日齡雞胚尿囊腔,35℃恒溫培養(yǎng)72小時(shí),收取雞胚尿囊液。血凝陽(yáng)性(AD≥16)且細(xì)菌培養(yǎng)陰性標(biāo)本進(jìn)一步做HI和NI實(shí)驗(yàn)以鑒定亞型,標(biāo)本保存于-80℃箱。從中選取18株H9N2病毒代表株進(jìn)行下一步的分子生物學(xué)工作。用Qiagen的RNeasy RNA試劑盒

6、提取病毒RNA后,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以之為模板,用針對(duì)不同基因片段設(shè)計(jì)的特異性引物,進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。以PCR純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物,然后進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序在在DNA測(cè)序儀(377)上進(jìn)行。用GCG10.2編輯和處理基因序列。用PAUP4.1進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析。在GeneDoc2.3上進(jìn)行序列比較和同源性分析。
　　結(jié)果:
　　1、以Pa、Cu為代表的小種群禽類(lèi)中,H9N2亞型常年流行;
　　2、抗原學(xué)分析結(jié)果表明,

7、這些病毒株都屬于Y280系列,與G9和SW9抗原性相似,而與anti-G1和anti-1073反應(yīng)性低;
　　3、進(jìn)化樹(shù)分析表明,這些基因型與同期同地在水禽中分離到的基因型具有很高的同源性;
　　4、基因型分析表明,有多個(gè)H9N2基因型存在,在這些新種群中經(jīng)歷復(fù)雜的篩選,某些基因型已趨于穩(wěn)定;
　　討論:
　　1、以PA、CU為代表的小種群禽類(lèi)是流感病毒的天然宿主—基因儲(chǔ)存庫(kù),還是流感病毒的中間宿主;
　　

8、2、僅有Y280系列H9N2亞型被檢測(cè)到,未發(fā)現(xiàn)G1系列,這是否意味著這些新種群對(duì)Y280具有更高的易感性;
　　3、多個(gè)基因型存在,這些重配病毒株產(chǎn)生的中間宿主—水禽還是這些小種群陸地禽類(lèi);
　　4、這些基因型在同期也從水禽中分離到,它們是由水禽經(jīng)跨種屬傳遞傳播給陸地禽類(lèi),還是反向傳播的結(jié)果;
　　5、眾多的基因型在小種群禽類(lèi)中經(jīng)過(guò)快速的篩選,大多很快地消失,但也有少數(shù)基因型已經(jīng)趨于穩(wěn)定,這些基因型的進(jìn)化情況;