鵝源H9N2亞型流感病毒的分離鑒定及在雞和鵝中天然免疫差異性分析.pdf

1、H9N2亞型禽流感的遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變，難以防制，已成為嚴(yán)重威脅中國養(yǎng)禽業(yè)的因素。本研究從江蘇省揚州市活禽市場和揚州大學(xué)動物醫(yī)院疑似禽流感病的病鵝中分離到三株鵝源H9N2亞型流感病毒，分別命名為A/Goose/Jiangsu/YZ527/2011(H9N2，縮寫 Gs/JS/YZ527/11)、A/Goose/Jiangsu/SQ119/2012(H9N2，縮寫 Gs/JS/SQ119/12)和A/Goose/Jiangsu/JD564/

2、2012（H9N2，縮寫Gs/JS/JD564/12），并對這三株病毒的基因特征、對雞和鵝的感染特性及其在鵝和雞中誘導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答的差異進行了分析。
　　基因特征結(jié)果顯示，Gs/JS/SQ119/12株的HA和PB2基因分別屬于G9-like分支和G1-like分支， Gs/JS/YZ527/11和Gs/JS/JD564/12株的HA和PB2均屬于F/98-like分支; Gs/JS/YZ527/11、Gs/JS/SQ119/1

3、2和Gs/JS/JD564/12三株病毒的NA、PB1、PA、NS和NP基因均屬于F/98-like分支;Gs/JS/YZ527/11和Gs/JS/SQ119/12的M基因?qū)儆贕1-like分支，Gs/JS/JD564/12的M基因?qū)儆贔/98-like分支，結(jié)果表明鵝源H9N2病毒Gs/JS/YZ527/11株由G1-like和F/98-like二個分支重組;Gs/JS/SQ119/12株是由G9-like、G1-like和F/98-

4、like三個分支重組而成; Gs/JS/JD564/12株的8個基因全部來自F/98-like分支。3個分離株的HA基因裂解位點均為RSSR↓GLF;但是在構(gòu)成受體結(jié)合位點的袋狀結(jié)構(gòu)的198位、233-234位氨基酸和糖基化位點有差異;與Ck/SH/F/98株相比，分離株NA基因上的紅細(xì)胞吸附位點和糖基化位點均發(fā)生了變化。致病性試驗表明，Gs/JS/JD564/12株都只能對一部分的雞和鵝產(chǎn)生感染性，Gs/JS/JD527/11和Gs/

5、JS/SQ119/12兩株病毒對雞、鵝都具有感染性。以上結(jié)果表明，同樣分離自鵝的三株H9N2亞型禽流感病毒的基因組來源復(fù)雜，對雞和鵝的感染率有顯著差異。
　　雞和鵝分別是禽流感病毒的陸生和水生宿主，通常雞對禽流感病毒較易感，而鵝對于禽流感病毒則有較強的抵抗能力，它們對于禽流感病毒都有其各自獨特的免疫應(yīng)答特征。本論文利用免疫熒光定量PCR方法，比較了本研究分離的三株鵝源H9N2亞型禽流感病毒感染雞和鵝免疫應(yīng)答的差異性。
　　G

6、s/JS/SQ119/12株在感染雞后第三天(3dpi)，誘導(dǎo)雞產(chǎn)生的TLR-7和IFN-γ的表達(dá)量顯著上調(diào)，與未感染雞出現(xiàn)明顯的差異，其中Gs/JS/SQ119/12攻毒組雞表達(dá)TLR-7和IFN-γ的量分別是未攻毒雞的3.7倍(P＜0.05)和2.2倍(P＜0.05);而Gs/JS/SQ119/12株在感染鵝1dpi，誘導(dǎo)鵝表達(dá)的TLR-7的量明顯升高，表達(dá)量是未攻毒鵝的4倍(P＜0.01)。Gs/JS/YZ527/11株在感染雞后

7、，只有IFN-γ的表達(dá)量在3dpi的時候有明顯的上調(diào)，表達(dá)量是未攻毒雞的2.1倍(P＜0.05)。表明宿主雞啟動了干擾素的抗病毒程序，但是其他因子的表達(dá)量并沒有發(fā)生顯著變化。Gs/JS/YZ527/11株在感染鵝1dpi，誘導(dǎo)鵝產(chǎn)生的TLR-7的表達(dá)量明顯上調(diào)，其表達(dá)量是未攻毒鵝的2.3倍（P＜0.05)。以上結(jié)果表明Gs/JS/SQ119/12株和Gs/JS/YZ527/11株一樣，在宿主鵝中啟動Toll樣受體的識別比在雞中更早和更快

8、。Gs/JS/JD564/12株在感染雞1dpi，誘導(dǎo)雞產(chǎn)生的TLR-7的表達(dá)量就顯著上調(diào)，是未感染雞的2.7倍(P＜0.05)。與Gs/JS/JD564/12株具有很高同源性的F/98株病毒，也在感染雞1dpi誘導(dǎo)雞產(chǎn)生的TLR-7的表達(dá)量就出現(xiàn)顯著地上調(diào)，其表達(dá)量是未攻毒雞的6.1倍(P＜0.01)。這表明鵝源Gs/JS/JD564/12株和雞源F/98株一樣，均能快速啟動宿主雞的天然免疫應(yīng)答，但是F/98株在雞中誘導(dǎo)的TLR-7的

9、表達(dá)量顯著高于Gs/JS/JD564/12株(P＜0.05)。在鵝宿主中，Gs/JS/JD564/12株在感染鵝1dpi，誘導(dǎo)鵝產(chǎn)生的TLR-21的表達(dá)量就出現(xiàn)了顯著地上調(diào)，為未攻毒鵝的4.2倍(P＜0.01)，并且誘導(dǎo)鵝產(chǎn)生的RIG-Ⅰ的表達(dá)量也出現(xiàn)顯著地上調(diào)，其表達(dá)量是未攻毒鵝的4.9倍(P＜0.01)。表明Gs/JS/JD564/12株同樣能快速地引起宿主鵝的天然免疫應(yīng)答。
　　在雞宿主中， Gs/JS/JD564/12株與

10、雞源F/98株誘導(dǎo)IL-1β表達(dá)的速度仍然有顯著差異，Gs/JS/JD564/12攻毒組雞IL-1β的表達(dá)量是在1 dpi就顯著上調(diào)，為未攻毒雞的5.5倍(P＜0.01);而F/98株攻毒組雞IL-1β的表達(dá)量在3 dpi時才開始顯著上調(diào)，是未攻毒雞的1.9倍(P＜0.05)，表明相對于F/98株，宿主雞能更迅速的清除Gs/JS/JD564/12株病毒。此外，感染了Gs/JS/JD564/12株的鵝體內(nèi)各因子表達(dá)量均顯著高于感染了Gs/

11、JS/JD564/12株的雞，這個差值在5 dpi達(dá)到最高峰。5dpi時，Gs/JS/JD564/12株誘導(dǎo)宿主鵝表達(dá)的TLR-21量是宿主雞的34.5倍(P＜0.01);IFN-α的表達(dá)量是宿主雞的46倍(P＜0.01);IFN-γ的表達(dá)量是宿主雞的21.6倍(P＜0.01);IL-1β的表達(dá)量是宿主雞的14倍(P＜0.01);IL-6的表達(dá)量是宿主雞的13.7倍(P＜0.01)。表明Gs/JS/JD564/12毒株不僅能迅速被宿主鵝

12、識別，并能引發(fā)比宿主雞更強烈的天然免疫反應(yīng)，這與F/98株能引起宿主雞產(chǎn)生比宿主鵝強烈的天然免疫反應(yīng)的結(jié)果剛好相反。分析Gs/JS/JD564/12和F/98株的基因序列發(fā)現(xiàn)，兩株病毒具有非常高的同源性，其HA，PB2，PB1，PA，NS，NP，M七個基因片段的同源性都達(dá)到了99.2％以上，只有NA基因的同源性為92.7％。與F/98株相比，Gs/JS/JD564/12株的NA基因在264位新增了一個糖基化位點NIS，此位點是否與兩株病