柑橘黃龍病可視化LAMP檢測(cè)體系的建立及其室內(nèi)防治藥劑篩選.pdf

1、柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing，HLB）是由韌皮部桿菌屬（Candidatus liberibacter）侵染引起的一種毀滅性病害，是國(guó)內(nèi)外植物檢疫對(duì)象之一。該病主要分布在亞洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50個(gè)國(guó)家和地區(qū)，中國(guó)19個(gè)柑橘生產(chǎn)省（市、自治區(qū)）中已有11個(gè)受到HLB的危害，對(duì)世界柑橘產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定和發(fā)展造成了嚴(yán)重的威脅。由于目前尚無(wú)有效防治藥劑和抗病品種，主要采取加強(qiáng)檢疫、挖除病樹(shù)、防治木虱和種植無(wú)病

2、苗木等防控措施，因此加強(qiáng)柑橘黃龍病的早期診斷和防治藥劑篩選，對(duì)于防止黃龍病疫情擴(kuò)散及有效防控尤為重要。
　　鑒于國(guó)內(nèi)學(xué)者建立的柑橘黃龍病LAMP檢測(cè)體系，在結(jié)果上或無(wú)法實(shí)現(xiàn)可視化，或采用的可視化方法（開(kāi)蓋加顯色指示劑）容易造成污染的問(wèn)題，本研究利用鈣黃綠素（Calcein）的熒光顯色指示劑作用，建立了可視化的柑橘黃龍病LAMP檢測(cè)體系，因Calcein在LAMP反應(yīng)開(kāi)始前加入，所以避免了因開(kāi)蓋操作而造成反應(yīng)產(chǎn)物污染。在該方法中，以

3、柑橘黃龍病菌16S rDNA靶序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物（2條內(nèi)引物、2條外引物)，通過(guò)調(diào)整反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、Mg2+、dNTP、甜菜堿和引物的濃度，優(yōu)化了LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，并對(duì)其特異性和靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證。研究確定最佳反應(yīng)溫度為65℃，反應(yīng)時(shí)間70 min。特異性檢測(cè)結(jié)果顯示：柑橘黃龍病菌總DNA樣品LAMP產(chǎn)物均為陽(yáng)性(綠色)，而其它9個(gè)供試樣品LAMP產(chǎn)物均為陰性(橘黃色)；靈敏度驗(yàn)證結(jié)果顯示：該檢測(cè)體系對(duì)感染黃龍病

4、菌的柑橘葉片總 DNA的檢出限為1.51×10-3 ng/μL，而對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒DNA的檢出限為2.12×10-6 ng/μL，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR， qPCR）靈敏度相當(dāng)，而比常規(guī)PCR靈敏度高1000倍。對(duì)田間采集的柑橘黃龍病疑似癥狀樣品分別采用LAMP和qPCR體系進(jìn)行檢測(cè)，并比較2種檢測(cè)方法的樣品檢出率和2種檢測(cè)方法間的檢測(cè)符合率，以驗(yàn)證可視化LAMP技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用效果。結(jié)果顯示

5、，從福建漳州、南平、福州等地區(qū)采集的30份具有柑橘黃龍病疑似癥狀的蘆柑葉片，可視化LAMP檢測(cè)技術(shù)和qPCR檢測(cè)技術(shù)的檢出率均為76.7％（23/30），2種檢測(cè)方法間的檢測(cè)符合率為100%，表明可視化LAMP檢測(cè)方法快速、簡(jiǎn)便、特異、靈敏，適合于基層部門(mén)和田間使用，為柑橘黃龍病早期診斷提供了一種新的手段。
　　由于HLB菌無(wú)法進(jìn)行純培養(yǎng)，導(dǎo)致防治藥劑篩選工作進(jìn)展緩慢。本文以消毒劑作為HLB防治的候選藥劑，開(kāi)展室內(nèi)防治藥劑篩選試驗(yàn)

6、。將染病接穗浸泡不同消毒劑后，分別嫁接到砧木上，利用qPCR技術(shù)分析不同藥劑處理前后黃龍病菌濃度的變化，采用相對(duì)防效評(píng)價(jià)體系進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而建立HLB防治藥劑的相對(duì)防效評(píng)價(jià)體系。結(jié)果表明，14種供試藥劑中有6種藥劑不適合此法；其余8種消毒劑能夠有效降低接穗黃龍病菌濃度，具有較高的相對(duì)防效。其中以三氯泡騰消毒片（TCCA）中有效氯含量為1250mg/L時(shí)，相對(duì)防效最佳，達(dá)到了88.9±0.47%。由于黃龍病菌在自然條件下會(huì)隨著季節(jié)的變化而發(fā)