中國(guó)柑橘黃龍病病原調(diào)查、種群遺傳分化及其原噬菌體溶菌酶蛋白原核表達(dá).pdf

1、柑橘黃龍病（Citrus Huanglongbing，HLB）是世界柑橘生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一，在亞洲、非洲、大洋洲和南北美洲的近50個(gè)國(guó)家和地區(qū)造成為害，在中國(guó)20個(gè)柑橘產(chǎn)區(qū)（包括臺(tái)灣）已有12個(gè)遭受HLB為害，且最近又有不斷擴(kuò)散蔓延的趨勢(shì);HLB病原菌能侵染幾乎所有柑橘類(lèi)植物，病樹(shù)癥狀表現(xiàn)復(fù)雜，主要表現(xiàn)為葉片斑駁型黃化、均勻型黃化、缺素型黃化和“紅鼻子”果等癥狀，造成植株經(jīng)濟(jì)壽命減短，產(chǎn)量降低，果品質(zhì)劣經(jīng)濟(jì)價(jià)值降低，從而引起巨大

2、的經(jīng)濟(jì)損失。由于HLB的病原物尚不能人工培養(yǎng)，因此科赫氏證病亦未完成。目前，國(guó)際上普遍認(rèn)為該病的病原為韌皮部桿菌屬的3個(gè)暫定種:亞洲種(‘Candidatus Liberibacterasiaticus’, CLas)、非洲種(‘Ca.L.africanus’，CLaf)和美洲種（‘Ca.L.americanus’，CLam）。目前該病尚無(wú)特效藥劑可供治療，也無(wú)抗（耐）病品種可供應(yīng)用，只能采取以防為主的防治措施。因此對(duì)該病的研究迫在眉睫

3、且具有一定的難度。
　　本研究從病害取樣檢測(cè)到田間癥狀識(shí)別，再到我國(guó)CLas種群分化和流行推測(cè)，以及探索防治該病害的新思路進(jìn)行了較系統(tǒng)的基礎(chǔ)性研究。其中田間診斷標(biāo)準(zhǔn)的確立在實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)病害的準(zhǔn)確識(shí)別具有重要的意義，由于HLB田間癥狀的復(fù)雜性，常會(huì)造成誤判，如何進(jìn)行準(zhǔn)確診斷將是面對(duì)實(shí)際生產(chǎn)中亟待解決的最現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。而對(duì)病原菌的種群分化研究有助于了解病菌分類(lèi)、種群結(jié)構(gòu)和病菌流行動(dòng)態(tài)，同時(shí)也為病原類(lèi)型檢測(cè)、病害診斷及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了一種敏感

4、特異的手段，因此區(qū)分CLas的不同株系對(duì)HLB的生態(tài)和流行學(xué)研究十分重要。鑒于國(guó)內(nèi)外對(duì)CLas遺傳多樣性及種群分化領(lǐng)域研究的不足，尤其是對(duì)中國(guó)CLas種群內(nèi)部多位點(diǎn)同時(shí)分析的缺乏，本學(xué)位論文利用比較基因組分析方法得到大量差異位點(diǎn)，通過(guò)篩選獲得用于評(píng)價(jià)我國(guó)CLas的種群多樣性的位點(diǎn)，并對(duì)306個(gè)樣品進(jìn)行多位點(diǎn)遺傳多樣性分析。旨在揭示中國(guó)CLas種群分化，并進(jìn)一步探索黃龍病在中國(guó)的起源及其流行。HLB病原菌CLas寄生于柑橘體內(nèi)，簡(jiǎn)單的化學(xué)

5、防治難度很大，且可操作性不強(qiáng)。CLas基因組中存在編碼CLas原噬菌體的溶菌酶基因，這是CLas噬菌體殺死CLas細(xì)胞的有力武器，本論文通過(guò)原核表達(dá)該溶菌酶，并進(jìn)一步驗(yàn)證該基因的溶菌活性，希望借助CLas噬菌體源溶菌酶與韌皮部無(wú)毒載體結(jié)合，運(yùn)用這個(gè)工具進(jìn)行HLB的有效防控，從而為HLB防控提供新思路。目前取得了如下研究成果:
　　1、首次通過(guò)在常規(guī)CTAB法DNA提取液中添加增效劑和抗低溫析出劑，獲得了一種增強(qiáng)型新配方CTAB-T

6、riton DNA提取液，并優(yōu)化操作時(shí)間，該法無(wú)論從質(zhì)量上還是從操作時(shí)間上均優(yōu)于常規(guī)CTAB抽提法，而質(zhì)量和產(chǎn)量均高于微量抽提法，產(chǎn)量?jī)?yōu)于DNA提取試劑盒。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)感病柚子葉片各部分病原含量進(jìn)行檢測(cè)，明確了柑橘黃龍病的取樣部位應(yīng)為葉柄或主側(cè)脈。這為柑橘產(chǎn)業(yè)各種DNA病害模板樣品的制備提供了一個(gè)新參考，同時(shí)對(duì)HLB病害檢測(cè)取樣部位的選擇具有一定的實(shí)際指導(dǎo)意義。
　　2、經(jīng)2009-2013年田間柑橘黃化癥狀調(diào)查，我國(guó)

7、柑橘系統(tǒng)性黃化癥狀主要由韌皮部桿菌屬的亞洲種韌皮部桿菌引起，從所采集的629份樣品中未發(fā)現(xiàn)美洲種、非洲種韌皮部桿菌和植原體。黃化癥狀樣品分子檢測(cè)和室內(nèi)傳毒癥狀觀察表明葉片斑駁型黃化癥狀與CLas最相關(guān)，可作為田間診斷的主要依據(jù)，果實(shí)成熟期還可結(jié)合“紅鼻子”果同時(shí)進(jìn)行診斷，以提高田間診斷的高效性和可靠性。本研究明確了我國(guó)柑橘主產(chǎn)區(qū)近幾年引起柑橘系統(tǒng)性黃化癥狀的主要病原，確立了HLB田間診斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)HLB田間識(shí)別與診斷具有一定的指導(dǎo)意義。<

8、br>　　3、通過(guò)CLas與根瘤菌科成員進(jìn)行比較基因組分析，篩選并設(shè)計(jì)79對(duì)引物，獲得14個(gè)變異位點(diǎn)，其中12個(gè)變異較為豐富。對(duì)這12對(duì)引物進(jìn)行退火溫度優(yōu)化，得到11個(gè)特異性較好的引物對(duì)來(lái)自中國(guó)9省306份CLas樣品和1個(gè)巴西CLas樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，6個(gè)位點(diǎn)能較好評(píng)估中國(guó)CLas種群類(lèi)型，聚類(lèi)結(jié)果顯示中國(guó)CLas共分兩大組，云貴川一組、兩廣閩贛浙為另一組。通過(guò)多個(gè)變異位點(diǎn)同時(shí)對(duì)CLas樣品進(jìn)行分析，從而推測(cè)中國(guó)CLas可能存

9、在云南和廣東兩個(gè)起源中心。這為HLB在中國(guó)的起源和流行推測(cè)提供了一定的分子依據(jù)。
　　4、首次提出使用（原）噬菌體源溶菌酶進(jìn)行HLB防控的思路，通過(guò)CLas基因組查找，在CLas原噬菌體區(qū)域找到了編碼溶菌酶蛋白的基因，并將其克隆測(cè)序驗(yàn)證序列后，通過(guò)構(gòu)建pTXB I-Lysozyme原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)獲得41 kDa大小的融合蛋白，且融合蛋白均為可溶表達(dá)，經(jīng)幾丁質(zhì)柱純化并去除標(biāo)簽，得到大小為19 kDa的溶菌酶蛋白，和預(yù)期預(yù)測(cè)完全一

10、致。該研究為后續(xù)CLas原噬菌體溶菌酶功能驗(yàn)證提供了一定的基礎(chǔ)，并有望將該溶菌酶通過(guò)無(wú)毒載體引入柑橘韌皮部，發(fā)揮殺菌活性，從而抑制或防治柑橘黃龍病。
　　綜上所述，本研究面對(duì)實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用檢測(cè)，對(duì)HLB的癥狀和CLas的相關(guān)性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，總結(jié)出較為可靠的HLB田間診斷標(biāo)準(zhǔn);通過(guò)實(shí)驗(yàn)明確了HLB取樣部位應(yīng)選葉柄或葉脈，而不應(yīng)選取葉肉;應(yīng)用比較基因組篩選多態(tài)性位點(diǎn)的方法對(duì)中國(guó)CLas進(jìn)行多位點(diǎn)種群分析，為中國(guó)CLas的種群分化和病