柑橘黃龍病Serralysin蛋白的表達(dá)純化及兩種重要病原的分子檢測(cè).pdf

1、柑橘是在世界范圍內(nèi)種植面積最廣、產(chǎn)量最大的重要的亞熱帶水果，但在柑橘種植、生產(chǎn)過程中存在一些嚴(yán)重問題，其中柑橘病害的廣泛流行是影響柑橘產(chǎn)業(yè)的重要因素。
　　1.柑橘黃龍病(HLB)是影響世界柑橘生產(chǎn)的最具毀滅性病害，目前我們對(duì)其致病機(jī)理還不太清楚。本文根據(jù)GenBank中提交的柑橘HLB亞洲型病原Serralysin蛋白基因序列，克隆了Serralysin蛋白N-端基因，命名為SerN;成功構(gòu)建了含SerN基因的重組質(zhì)粒pMD19

2、-T-SerN，測(cè)序結(jié)果與GenBank中的原始序列100％同源;構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET24a-SerN,在E.coli中進(jìn)行異源表達(dá)，通過Ni2+-NTA親和柱純化SerN蛋白，優(yōu)化蛋白表達(dá)及純化條件。
　　2.SerN蛋白在不同表達(dá)菌株中進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果表明在E.colipLysS中表達(dá)情況較好，經(jīng)超聲破碎以后SerN蛋白在上清與沉淀中均有表達(dá)，多數(shù)以包涵體形式存在;采用不同IPTG濃度誘導(dǎo)SerN蛋白表達(dá)，結(jié)果表明在IPTG

3、濃度為0.05mM時(shí)SerN蛋白在上清中的表達(dá)量最高;不同的Bindingbuffer對(duì)SerN蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果表明Bindingbuffer對(duì)SerN蛋白純化效果的影響并不明顯，對(duì)蛋白溶解性沒有明顯改觀;咪唑梯度洗脫結(jié)果表明SerN蛋白與Ni2+-NTA柱親和能力弱，在咪唑濃度為5mM即隨雜蛋白一起洗脫;降低Bindingbuffer中鹽濃度不能提高SerN蛋白的溶解性，PBS緩沖液中NaCl濃度為500mM時(shí)蛋白在上清中表達(dá)量明顯

4、高于其他情況。
　　3.對(duì)來自不同柑橘產(chǎn)區(qū)的101個(gè)樣品進(jìn)行柑橘HLB的常規(guī)PCR檢測(cè)和實(shí)時(shí)定量PCR(QPCR)檢測(cè)，判斷其是否感染柑橘HLB。其中常規(guī)PCR檢測(cè)出4個(gè)疑似攜帶柑橘HLB的樣品，而QPCR檢測(cè)出28個(gè)疑似攜帶柑橘HLB的樣品。比較這兩種檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)QPCR檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)高于常規(guī)PCR檢測(cè)，這可能與待測(cè)植株病菌含量有關(guān)。
　　4.本文克隆了柑橘衰退病(CTV)病原p23蛋白(GenBank登錄號(hào)為AFD332