水稻轉(zhuǎn)GAFP基因?qū)y枯病抗性的研究.pdf

1、立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)引起的水稻紋枯病是水稻生產(chǎn)中重要的真菌病害，發(fā)病嚴(yán)重時可導(dǎo)致巨大的產(chǎn)量損失和嚴(yán)重的品質(zhì)降低。天麻抗真菌蛋白(Gastrodiaantifungalprotein,簡稱GAFP)是從我國傳統(tǒng)中藥天麻(GastrodiaealatBl.)中分離得到的一種具有廣譜抗真菌活性的蛋白質(zhì)，它對許多植物的致病真菌有很強(qiáng)的抑制活性，因此在植物抗真菌病基因工程上有很重要的應(yīng)用價(jià)值。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以

2、打破物種間的生殖隔離而充分利用自然界中的基因，為選育新品種提供了全新、有效的輔助途徑。
　　 本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將天麻抗真菌蛋白(GAFP)的基因GAFP分別轉(zhuǎn)入粳稻徐稻3號和秈稻R6547中，并檢測這些基因在受體植物內(nèi)的整合、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，然后將所獲得的轉(zhuǎn)化植株后代在大田中進(jìn)行抗病性鑒定，通過篩選試圖獲得對紋枯病有顯著抵抗能力的水稻新品系。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化
　　 (1)NaCl

3、O濃度及消毒時間的確定
　　 通過研究發(fā)現(xiàn)將去殼水稻種子經(jīng)70％酒精浸泡1-2min后用25％NaClO消毒30min是水稻成熟胚種子適宜的滅菌方法。
　　 (2)添加ABA對水稻愈傷的影響
　　 在水稻品種R6547組織培養(yǎng)過程中，添加一定濃度的ABA有利于抑制胚芽的過度生長，使愈傷組織結(jié)構(gòu)致密，提高誘導(dǎo)率。
　　 2、轉(zhuǎn)基因水稻植株后代的分子檢測
　　 通過PCR檢測確認(rèn)了陽性轉(zhuǎn)化株，用Sou

4、thern雜交進(jìn)一步證實(shí)了GAFP基因已整合到受體植物基因組，用RT-PCR驗(yàn)證了SG2基因在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR檢測了SG2基因在植物細(xì)胞中的相對表達(dá)量。遺傳分析表明，GAFP基因在轉(zhuǎn)基因后代中的分離符合3:1的理論比例。
　　 3、T2代轉(zhuǎn)基因水稻植株的田間抗性鑒定
　　 (1)徐稻3號（粳稻）背景的紋枯病抗性鑒定
　　 徐稻3號有5個載體的轉(zhuǎn)化后代進(jìn)入抗性鑒定試驗(yàn)，5個載體分別為G3、SG3、G

5、4、SG4、SG2。研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，天麻抗真菌蛋白基因的轉(zhuǎn)化后代，病情極顯著地被減輕了。其中載體SG2的抗性效果最佳，表現(xiàn)出在輕病年病級減輕2.03級。
　　 (2)R6547（秈稻）背景的紋枯病抗性鑒定
　　 R6547有5個載體的轉(zhuǎn)化后代進(jìn)入抗性鑒定試驗(yàn)，5個載體分別為G1、G2、G4、SG3、SG4。研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，天麻抗真菌蛋白基因的轉(zhuǎn)化后代，病情極顯著地被減輕了。其中載體SG3的抗性效果最佳，表現(xiàn)出