草魚呼腸孤病毒(GCRV096)VP6和NS38蛋白的免疫原性及其相互作用蛋白的篩選.pdf

1、草魚出血病發(fā)病率高、流行范圍廣，且缺乏有效的防治藥物，是草魚養(yǎng)殖發(fā)展中的瓶頸問題。草魚呼腸孤病毒(Grass Carp Reovirus，GCRV)是草魚出血病的主要病原，主要危害草魚魚種，嚴(yán)重影響著我國淡水漁業(yè)的發(fā)展。實踐證明，免疫預(yù)防是預(yù)防該病最為有效的方法之一。但是，GCRV與其它的魚類呼腸孤病毒之間無交叉抗原，且不同病毒株之間也存在著抗原性差異。有研究表明VP6蛋白誘導(dǎo)中和抗體效價較高，NS38蛋白誘導(dǎo)的中和抗體效價次之。進一步

2、了解VP6和NS38蛋白的免疫原性有助于完善草魚出血病的免疫預(yù)防方法。病毒入侵宿主后，在宿主細胞內(nèi)大量繁殖，使細胞發(fā)生病變，致使宿主發(fā)病死亡。深入了解GCRV的侵染機制，找到與病毒蛋白相互作用的宿主蛋白，對病害的防治具有指導(dǎo)作用。本實驗以草魚呼腸孤病毒株096(GCRV096)為研究對象，克隆表達VP6和NS38基因，研究VP6和NS38蛋白的免疫原性；應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與GCRV096 VP6和NS38蛋白相互作用的宿主蛋白。

3、r>　　克隆VP6和NS38基因，分別構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET28a-VP6及pET28a-NS38，然后導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)進行表達，純化目的蛋白。用純化的目的蛋白分別與CIK細胞孵育12h、24h、48h，然后對CIK細胞進行病毒感染13h，熒光定量分析不同時間CIK細胞中VP6及NS38基因的表達量。實驗結(jié)果表明，VP6和NS38蛋白引發(fā)CIK細胞免疫效應(yīng)的強度隨孵育時間的增長而增強，48h時免疫效應(yīng)最好，VP6蛋白表現(xiàn)的

4、更為明顯。用GCRV096感染CIK細胞(蛋白孵育48h)4h、8h、13h，熒光定量分析結(jié)果表明，孵育8h時VP6蛋白引發(fā)的免疫效應(yīng)最強，而NS38蛋白是4h。
　　分別將VP6和NS38基因克隆到誘餌載體pGBKT7，構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP6及pGBKT7-NS38，轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold，并對誘餌質(zhì)粒進行自激活作用及毒性檢測，結(jié)果表明誘餌質(zhì)粒構(gòu)建成功。利用SMART技術(shù)構(gòu)建了草魚腎臟細胞(CIK)的全長cDNA文

5、庫，其文庫容量為2.4×106，文庫滴度為6.44×107cfu/mL。將含有誘餌質(zhì)粒的Y2HGold菌株與含有文庫質(zhì)粒的Y187菌株相融合，按照MatehmarkerTM GoldYeast Two-Hybrid System操作手冊篩選陽性克隆，通過高選擇性培養(yǎng)基確定陽性克?。禾崛￡栃钥寺〉慕湍纲|(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌并提純質(zhì)粒DNA，將其與誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold，確定相互作用，并對陽性克隆中插入的cDNA進行測序分析。在

6、VP6相互作用蛋白的篩選中得到4株陽性克隆，經(jīng)比對分析得到兩種與其相互作用的蛋白，其中一種與glyeeraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)高度同源，另一種未找到典型的同源蛋白；而。NS38蛋白得到3株陽性克隆，經(jīng)比對分析得到兩種與其相互作用的蛋白，其中一種與40S核糖體蛋白S16亞基高度同源，另一種未找到典型的同源蛋白。
　　本論文對GCRV096 VP6和NS38蛋白的免疫原性進行