17605.草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白vp7核酸疫苗的研究

1、學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學(xué)位是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作和取得的研究成果。本論文中除引文外，所有實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)和有關(guān)材料均是真實(shí)的。本論文中除引文和致謝的內(nèi)容外，不包含其他人或其它機(jī)構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。其他同志對本研究所做的貢獻(xiàn)均已在論文中作了聲明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名：玲哿襲日期：知m㈠7學(xué)位論文使用授權(quán)聲明研究生在校攻讀學(xué)位期間論文工作的知識產(chǎn)權(quán)單位屬南京師范大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保存本學(xué)位論文的電子和紙質(zhì)

2、文檔，可以借閱或上網(wǎng)公布本學(xué)位論文的部分或全部內(nèi)容，可以采用影印、復(fù)印等手段保存、匯編本學(xué)位論文。學(xué)?？梢韵驀矣嘘P(guān)機(jī)關(guān)或機(jī)構(gòu)送交論文的電子和紙質(zhì)文檔，允許論文被查閱和借閱。(保密論文在解密后遵守此規(guī)定)保密論文注釋：本學(xué)位論文屬于保密論文，保密期限為年。學(xué)位論文作者簽名：徐彳尋嶷日期：h伍、上、門艚教師虢傅紓。日期：M工r、[p摘要摘要草魚(CtenopharyngodonidelIus)是我國淡水養(yǎng)殖的主要品種之一。長期以來，草魚出

3、血病(hemorrhagicdiseaseofgrasscarp)發(fā)病率較高，死亡率高達(dá)80％以上，草魚呼腸孤病毒(grasscarpreovirus，GCRV)已被證實(shí)為草魚出血病的病原。GCRV隸屬呼腸孤病毒科(Reoviridae)，水生呼腸孤病毒屬(Aquareovirus)，是中國分離鑒定的第一株魚類病毒，也是水生呼腸孤病毒屬中致病力最強(qiáng)的毒株。GCRV主要侵染于草魚肝臟、心臟、肌肉、腎臟、脾、鰓、腸道等活的組織細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致化

4、學(xué)藥物難于達(dá)到治療效果，已成為草魚養(yǎng)殖發(fā)展中的“瓶頸”問題。GCRV不僅感染草魚，而且還感染青魚、麥穗魚以及某些海水魚等養(yǎng)殖魚類，對淡水養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。GCRV為立體對稱的20面體球形顆粒，由RNA核心和多層衣殼(內(nèi)殼層、中間層與外殼層)組成，其基因組為11條分節(jié)段的雙鏈RNA(doublestrandRNA，dsRNA)。近幾年，基因序列分析和三維結(jié)構(gòu)研究表明，成熟的GCRV顆粒由7種衣殼蛋白(VPl～vP7)組成，其中VP5

5、和VP7為病毒外衣殼組分，VP7蛋白是由GCRV第10片段編碼，己被揭示其在病毒感染及致病過程中起著不可替代的作用，并且具有較好的抗原性。VP5和VP7抗體都能與抗原中和，且VP7的抗體中和活性是VP5的3倍，表明VP7可能是GCRV主要的抗原決定簇，含有VP7基因的重組質(zhì)粒又可成功轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中，使研制GCRV基因疫苗成為可能。核酸疫苗，又稱基因疫苗或DNA疫苗，是通過基因工程改造的DNA注入機(jī)體后產(chǎn)生免疫應(yīng)答來防治疾病一種新型疫苗

6、。具有抗原性強(qiáng)、保護(hù)時間長、安全性好、制備和運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)，大大克服了滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗等所存在的缺陷，已引起行業(yè)內(nèi)的廣泛關(guān)注。將團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)的8肌動蛋白啟動子控制的VP7基因克隆進(jìn)桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMDual中，同時將另一拷貝的VP7基因置于桿狀病毒多角體蛋白(polh)基因啟動子控制之下，構(gòu)建VP7基因核酸疫苗表達(dá)載體pFastBac—B—VP7lVP72。初

7、步開展了核酸疫苗的免疫效果以及對草魚出血病的免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)三個重組基因疫苗pFastBac一13VP7l—VP72劑量組，注射劑量分別為10峙、30“g、60嶺，空載體組注射pFastBacTMDual30pg，對照組不注射任何疫苗。免疫后第14、21、28、49、70天對草魚進(jìn)行尾靜脈取血，通過RT—PCR檢測核酸疫苗的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄情況，問接凝集反應(yīng)測定抗體水平，第21天攻毒試驗(yàn)來檢測各組的免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pFast