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3、血病(hemorrhagicdiseaseofgrasscarp)發(fā)病率較高,死亡率高達(dá)80%以上,草魚呼腸孤病毒(grasscarpreovirus,GCRV)已被證實(shí)為草魚出血病的病原。GCRV隸屬呼腸孤病毒科(Reoviridae),水生呼腸孤病毒屬(Aquareovirus),是中國分離鑒定的第一株魚類病毒,也是水生呼腸孤病毒屬中致病力最強(qiáng)的毒株。GCRV主要侵染于草魚肝臟、心臟、肌肉、腎臟、脾、鰓、腸道等活的組織細(xì)胞內(nèi),導(dǎo)致化
4、學(xué)藥物難于達(dá)到治療效果,已成為草魚養(yǎng)殖發(fā)展中的“瓶頸”問題。GCRV不僅感染草魚,而且還感染青魚、麥穗魚以及某些海水魚等養(yǎng)殖魚類,對淡水養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。GCRV為立體對稱的20面體球形顆粒,由RNA核心和多層衣殼(內(nèi)殼層、中間層與外殼層)組成,其基因組為11條分節(jié)段的雙鏈RNA(doublestrandRNA,dsRNA)。近幾年,基因序列分析和三維結(jié)構(gòu)研究表明,成熟的GCRV顆粒由7種衣殼蛋白(VPl~vP7)組成,其中VP5
5、和VP7為病毒外衣殼組分,VP7蛋白是由GCRV第10片段編碼,己被揭示其在病毒感染及致病過程中起著不可替代的作用,并且具有較好的抗原性。VP5和VP7抗體都能與抗原中和,且VP7的抗體中和活性是VP5的3倍,表明VP7可能是GCRV主要的抗原決定簇,含有VP7基因的重組質(zhì)粒又可成功轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中,使研制GCRV基因疫苗成為可能。核酸疫苗,又稱基因疫苗或DNA疫苗,是通過基因工程改造的DNA注入機(jī)體后產(chǎn)生免疫應(yīng)答來防治疾病一種新型疫苗
6、。具有抗原性強(qiáng)、保護(hù)時間長、安全性好、制備和運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn),大大克服了滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗等所存在的缺陷,已引起行業(yè)內(nèi)的廣泛關(guān)注。將團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)的8肌動蛋白啟動子控制的VP7基因克隆進(jìn)桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMDual中,同時將另一拷貝的VP7基因置于桿狀病毒多角體蛋白(polh)基因啟動子控制之下,構(gòu)建VP7基因核酸疫苗表達(dá)載體pFastBac—B—VP7lVP72。初
7、步開展了核酸疫苗的免疫效果以及對草魚出血病的免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)三個重組基因疫苗pFastBac一13VP7l—VP72劑量組,注射劑量分別為10峙、30“g、60嶺,空載體組注射pFastBacTMDual30pg,對照組不注射任何疫苗。免疫后第14、21、28、49、70天對草魚進(jìn)行尾靜脈取血,通過RT—PCR檢測核酸疫苗的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄情況,問接凝集反應(yīng)測定抗體水平,第21天攻毒試驗(yàn)來檢測各組的免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒pFast
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