草魚(yú)呼腸孤病毒誘導(dǎo)FHM細(xì)胞凋亡及表達(dá)VP6蛋白重組桿狀病毒的構(gòu)建.pdf

1、草魚(yú)呼腸孤病毒(Grass Carp reovirus，GCRV)是由我國(guó)分離鑒定的第一株魚(yú)類病毒，也是目前水生呼腸孤病毒屬中致病力最強(qiáng)的病毒之一，該病毒不僅感染草魚(yú)，而且還可以感染鰱魚(yú)、布氏鰲條魚(yú)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 本研究圍繞GCRV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和桿狀病毒載體疫苗兩個(gè)方面展開(kāi)了以下研究:
　　 1.GCRV誘導(dǎo)FHM細(xì)胞凋亡的初步研究
　　 將GCRV分別感染草魚(yú)腎細(xì)胞(Ctenopha

2、ryngodon idellus kidney cell，CIK)和胖頭鯉細(xì)胞(Fathead minnow cell，F(xiàn)HM)，在不同時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞病變效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)GCRV均可引起這兩種細(xì)胞病變，但發(fā)生病變的細(xì)胞在形態(tài)上有所不同，GCRV對(duì)CIK細(xì)胞更為敏感，可以使感染的CIK細(xì)胞快速融合并裂解，而被感染的FHM細(xì)胞很少有細(xì)胞融合，并且細(xì)胞不會(huì)被裂解;利用DAPI、Annexin V-FITC染色和TUNEL技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)GCRV能夠誘

3、導(dǎo)FHM細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，但不能誘導(dǎo)CIK細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。本研究首次發(fā)現(xiàn)GCRV可以誘導(dǎo)FHM細(xì)胞發(fā)生凋亡，并推測(cè)GCRV在感染不同類型的細(xì)胞時(shí)，可以以不同機(jī)制促使細(xì)胞死亡，從而為進(jìn)一步研究GCRV的致病機(jī)制提供線索。
　　 2.表達(dá)GCRV VP6蛋白的重組桿狀病毒構(gòu)建及其誘導(dǎo)草魚(yú)免疫反應(yīng)的評(píng)價(jià)
　　 克隆GCRV VP6基因，并將其插入桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFast-CMV-VP6，將其轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)

4、胞DH10Bac后，經(jīng)過(guò)多次篩選及純化，獲得陽(yáng)性重組子rBacmid-CMV-VP6;將重組子在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞sf9，最后獲得重組桿狀病毒Bae-CMV-VP6;將重組桿狀病毒Bac-CMV-VP6感染sf9、EPC和CIK細(xì)胞，通過(guò)間接免疫熒光檢測(cè)，證明VP6蛋白均可以在這三種細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá);將該重組桿狀病毒免疫10-15cm草魚(yú)，劑量為109 PFU/條，并在免疫后第7d、14d、21d采集免疫魚(yú)的肝臟和脾臟，利用熒光定量