EV71型VP1蛋白在家蠶桿狀病毒表面的展示及其免疫原性的初步研究.pdf

1、腸道病毒71型(Enterovirus71,EV71)屬小RNA病毒科腸道病毒屬成員,和柯薩奇病毒A16都是導(dǎo)致手足口病的主要病原體,并能引起無菌性腦膜炎、肺水腫等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的并發(fā)癥,感染和病死率高,備受社會(huì)關(guān)注。近年來,EV71感染引起的手足口病在亞太地區(qū),尤其在我國北京、安徽、河南、山東等地疫情較為嚴(yán)重。
　　 通過對EV71 VP1基因進(jìn)行抗原表位分析,擴(kuò)增一段抗原表位基因,克隆至原核表達(dá)載體pET-28a上,將得

2、到的重組表達(dá)載體pET-28a-VP1經(jīng)PCR、雙酶切鑒定及測序后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3),誘導(dǎo)表達(dá)該抗原蛋白并鎳柱親和層析純化,進(jìn)行質(zhì)譜分析,將純化的抗原蛋白免疫新西蘭雄兔制備多克隆抗體,ELISA檢測得到的抗血清效價(jià)可達(dá)1:51200以上。針對桿狀病毒gp64基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,找出其中的信號肽序列SP和跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域TM(含胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域),與EV71 VP1重組構(gòu)建成重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBacl-SP-VP1

3、-TM。該重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,通過藍(lán)白斑篩選獲得成功轉(zhuǎn)座的重組Bacmid DNA,進(jìn)而通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞獲得重組桿狀病毒Bmgp64VP1。以第三代感染復(fù)數(shù)為MOI=10的重組桿狀病毒Bmgp64VP1分別接種家蠶5齡幼蟲和家蠶蛹,待發(fā)病后分別收獲家蠶5齡幼蟲蠶血淋巴和家蠶蛹,進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western blotting分析結(jié)果表明,VP1融合蛋白在家蠶生物反應(yīng)器中成功表達(dá)。經(jīng)過勻漿

4、、分級離心、超濾和超速離心等方法從家蠶蛹中分離純化獲得重組囊膜病毒粒子,經(jīng)Western blotting檢測后,免疫新西蘭雄兔制備抗血清并測定其效價(jià)可達(dá)1:2560以上。
　　 本研究成功構(gòu)建了重組家蠶桿狀病毒VP1表面展示系統(tǒng),EV71 VP1融合蛋白基因在家蠶BmN細(xì)胞、家蠶5齡幼蟲和家蠶蛹中可有效、穩(wěn)定地表達(dá),目的蛋白可展示于桿狀病毒囊膜表面,能通過一系列分離純化方法從家蠶蛹中獲得含EV71 VP1抗原蛋白的重組囊膜病毒