HLB感染柑桔韌皮部?jī)?nèi)生細(xì)菌區(qū)系的研究.pdf

1、柑橘是世界上產(chǎn)量最大的水果，巴西是世界上產(chǎn)柑橘最多的國(guó)家，其次是中國(guó)、美國(guó)、墨西哥和西班牙。柑桔黃龍?。–itrus huanglongbing，HLB）是由難人工培養(yǎng)的韌皮桿菌（Cndidatus Liberibacter asiaticus）引起的柑桔毀滅性病害。目前還沒(méi)有獲得該病原菌的純培養(yǎng)。新近的分子鑒定結(jié)果表明黃龍病罹病組織內(nèi)除存在韌皮桿菌外，還存在其它致病微生物：植原體或伴生微生物，并認(rèn)為其可能是黃龍病植株癥狀表現(xiàn)復(fù)雜多樣的

2、內(nèi)在原因。
　　 本研采用常規(guī)分離培養(yǎng)技術(shù)與分子鑒定以及基于16S rDNA基因的RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）法，對(duì)柑桔黃龍病植株和健康植株的韌皮部?jī)?nèi)生菌區(qū)系進(jìn)行比較分析，為研究柑橘植株韌皮部?jī)?nèi)生細(xì)菌與黃龍病菌之間的相互關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　 利用分離培養(yǎng)的方法，根據(jù)菌落形態(tài)以及菌體形態(tài)共分離到21株柑桔韌皮部?jī)?nèi)生細(xì)菌，對(duì)21株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)和生理生化測(cè)定。

3、經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定和序列比對(duì)：菌株WJ01，WJ02，WJ03，WJ05，WJ08，WJ12，WJ13，WJ16，WJ17，WJ18，WJ21為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.），WJ04和WJ14為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），WJ06為葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.），WJ10為考克氏菌（Kocuria sp.）。其中鑒定到種的部分菌株：WJ07：約氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter johnso

4、nii）、WJ09：粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）、WJ11：乳桿菌屬草乳桿菌（Lysinibacillus graminis）、WJ15：微球菌屬棲息微球菌（Miccrococcus sedentarius）、WJ19：產(chǎn)左聚糖微桿菌（Microbacterium laevaniformans）、WJ20；極小短小桿菌（Curtobacterium pusillum）的特征。在健康柑橘植株韌皮部中Bacillu

5、s sp.、Pseudomonas sp.、Kocuria sp.為優(yōu)勢(shì)菌群。在HLB柑橘植株韌皮部中Microbacterium sp.、Bacillus sp.、 Pseudomonas sp.和Kocuria sp. 為優(yōu)勢(shì)菌。且病株與健株相比，WJ19（Microbacterium sp.）的豐富度增加最為明顯。
　　 利用16S rDNA-RFLP的方法分析柑桔內(nèi)生細(xì)菌多樣性。首先采用的保守性引物分別擴(kuò)增健康和罹病柑桔

6、韌皮部總內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA 中的高變區(qū)V5、V6、V7、V8 及V9，得到的片段長(zhǎng)度約為 700bp?；厥债a(chǎn)物進(jìn)行T-A 克隆，健株與病株分別隨機(jī)挑取了229，228個(gè)陽(yáng)性克隆子，進(jìn)行 PCR 檢測(cè)。提取陽(yáng)性克隆子的質(zhì)粒。含有的目的片段的質(zhì)粒分別用MspⅠ，RsaⅠ，HaeⅢ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。鑒別分析各個(gè)陽(yáng)性克隆的酶切圖譜類型，對(duì)文庫(kù)中的所有克隆進(jìn)行分型，不同的類型即是不同的分類操作單位（Operational Taxonom

7、ic Unit，OUT）。將不同的 OTUs 進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank 中的序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示：鑒定出10個(gè)屬的細(xì)菌以及 11個(gè)不可培養(yǎng)細(xì)菌，其中 9個(gè) OTUs的序列與 GenBank 中的序列比對(duì)相似性≤ 97％，這些可能是還未經(jīng)過(guò)序列測(cè)定過(guò)的新菌種。不同屬的RFLP OUTs在健株（health plant，HP）與病株（infected plant，IP）的 16S rDNA 克隆文庫(kù)中所占的比率不同，分析結(jié)

8、果顯示：Dyella sp.（HP 27.08％；IP 25％），Enterobacter sp.（HP 3.93％；IP 0％），Serratia marcescens（HP16.16％；IP 18.86％），Enterococcus sanguinicola（HP 3.06％；IP 3.95％），Achromobacter sp.（HP 1.75％；IP 1.32％），Bosea sp.（HP 1.31％；IP 0.44％），Lys

9、inibacillus fusiformis（HP 0％；IP 0.88％），Candidatus Liberibacter asiaticus（HP 0％；IP 3.07％），Bacillus sp.（HP 1.31％；IP 1.31％），Pseudomonas sp.（HP 17.03％；IP 17.54％），Uncultured bacterium clone（HP 28.38％；IP 27.63％）。
　　 常規(guī)分離培養(yǎng)

10、與 16S rDNA-RFLP的分析方法得到的結(jié)果不一致，這說(shuō)明每種方法都有一定的優(yōu)勢(shì)性和局限性；單一使用存在局限性，需要兩種方法結(jié)合，能夠更全面地分析柑桔韌皮部?jī)?nèi)生細(xì)菌的多樣性。
　　 常規(guī)分離培養(yǎng)與 16S rDNA-RFLP的序列分析研究結(jié)果表明：健康和罹病柑桔的韌皮部都存在豐富的內(nèi)生細(xì)菌，且這些內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌的種群豐富度與種類存在一定差異。深入研究黃龍病侵染后韌皮部中存在的 Microbacterium sp. 等不同的