兩種韌皮部桿菌媒介木虱內(nèi)生原核生物和線粒體基因組研究.pdf

1、亞洲柑橘木虱Diaphorina citri和馬鈴薯木虱Bactericeracockerelli是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要害蟲。其中亞洲柑橘木虱為候選的韌皮部桿菌“Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）”和“Ca.L.americanus”的媒介昆蟲，該細(xì)菌與柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing）密切相關(guān)，給全世界柑橘生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅。馬鈴薯木虱主要為害馬鈴薯、番茄、辣椒等茄科植物，不僅

2、造成“木虱黃葉病”，還是馬鈴薯斑馬?。╖ebra chipdisease）病原“Ca.L.solanacearum（CLso）”的媒介昆蟲。這兩種病原菌均為難培養(yǎng)細(xì)菌，目前沒有有效的藥劑進(jìn)行控制，因此對著兩種媒介昆蟲的研究和從基因組中獲取有用的生物信息對防控柑橘黃龍病和馬鈴薯斑馬病有著重要的指導(dǎo)作用。本文首先探索亞洲柑橘木虱和馬鈴薯木虱的人工飼養(yǎng)方法和獲取韌皮部桿菌的規(guī)律，得到帶菌量高的木虱DNA樣品并用于第二代測序（Next Gene

3、ration Sequencing，NGS），組裝兩種媒介昆蟲所攜帶的內(nèi)生原核生物和線粒體基因組，并進(jìn)一步分析和應(yīng)用。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　（1）通過比較九里香Murraya exotica、酸橘Citrus sunki和馬水橘Citrus reticulate三種寄主不同成熟度的梢對柑橘木虱各齡若蟲和成蟲存活率的影響，發(fā)現(xiàn)柑橘木虱若蟲的生長發(fā)育依賴于嫩梢，而成蟲在成熟梢上的存活率高于嫩梢，且酸橘上飼養(yǎng)效果較好。
　

4、　通過研究兩個(gè)番茄Solanum lycopersicum品種（“Big boy”和“Yellow pearl”）對馬鈴薯木虱若蟲和成蟲生物學(xué)特性的影響，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯木虱在“Yellow pearl”上的4齡若蟲和產(chǎn)卵前期更短，且若蟲總存活率和成蟲存活率顯著高于“Big boy”。
　?。?）亞洲柑橘木虱和馬鈴薯木虱的若蟲期獲菌率和獲菌量均高于成蟲期，分別在飼菌后第6 d和第12 d開始達(dá)到顯著性差異。馬鈴薯木虱成蟲獲菌效率遠(yuǎn)高于亞

5、洲柑橘木虱，第18 d已達(dá)90％，且CT值顯著下降，而亞洲柑橘木虱只達(dá)到33.33%，CT值仍沒有顯著變化，此時(shí)馬鈴薯木虱的韌皮部桿菌拷貝數(shù)約為亞洲柑橘木虱的3倍。
　?。?）通過兩種木虱的測序文庫進(jìn)行組裝得到內(nèi)生原核生物基因組，其中亞洲柑橘木虱樣本中獲得柑橘黃龍病病原細(xì)菌CLasYCPsy株系，原生共生菌“Ca.Carsonella ruddii”YCCR株系，次生共生菌“Ca.Profftella armature”YCPA株

6、系的染色體和質(zhì)?；蚪M；另外在該樣本組裝序列中找到與Wolbachia sp.相關(guān)的291個(gè)序列。
　　馬鈴薯木虱樣本中獲得馬鈴薯斑馬病病原細(xì)菌CLso RSTM株系，并首次報(bào)導(dǎo)了原生共生菌“Ca.C.ruddii”BC株系和與次生共生菌Wolbachiasp.相關(guān)的605個(gè)序列。
　?。?）首次獲得亞洲柑橘木虱和馬鈴薯木虱完整的線粒體基因組。其中采自美國加利福尼亞州的馬鈴薯木虱線粒體全基因組大小為15220 bp，采自中國

7、廣東省和美國加利福尼亞州的亞洲柑橘木虱線粒體全基因組分別為14996和15013 bp。三個(gè)線粒體基因組均含有13個(gè)蛋白編碼基因、2個(gè)核糖體RNA基因、22個(gè)轉(zhuǎn)移RNA基因和1個(gè)控制區(qū)?；蚺判蚓c昆蟲原始線粒體的順序相同。
　　通過對馬鈴薯木虱與GenBank數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有三種木虱（枸杞木虱Paratrioza sinica，木通木虱Cacopsylla coccinea和樸樹木虱Pachypsylla venusta）線粒體基因組

8、的13個(gè)基因的核酸多態(tài)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)cox1基因最保守；對這4個(gè)基因組控制區(qū)進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯木虱多出一段260 bp的特異序列，并能形成3個(gè)莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)?；?3個(gè)蛋白編碼基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其結(jié)果與基于形態(tài)學(xué)的分類結(jié)果一致。
　　采自中國廣東省和美國加州的亞洲柑橘木虱的線粒體基因組存在52個(gè)變異堿基。通過3種方法（cox1基因、trnAsn基因和利用3個(gè)nad基因的常規(guī)PCR）驗(yàn)證采自中國和美國多個(gè)地區(qū)的木虱樣品，結(jié)果表明